蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响

冯丹 刘婷 李冠汝 孙丽蕴

环境污染导致大气臭氧层的破坏日益加剧，紫外线(ultraviolet radiation，UV)辐射水平增加。紫外线辐射，特别是紫外线B(ultraviolet-B，UVB)290～320 nm直接作用于HaCaT细胞，通过诱导氧化应激、炎症过程进而影响皮肤屏障功能，形成光损伤[1]。UVB辐射抑制HaCaT细胞内源性抗氧化剂超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性并增加氧化终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的产生[2]，UVB诱导的细胞损伤会激活炎性细胞因子，并能够抑制细胞增殖和转化生长因子β(transforming growth facor-β,TGF-β)通路调控的胶原蛋白的表达[3-4]，这是导致HaCaT细胞光损伤的重要内容。中医药治疗光敏感性皮肤反应具有很好的疗效，应用前景广阔[5]。蒿秦化斑方在临床中应用治疗光敏感性皮肤病取得了较好的疗效，由青蒿、秦艽、丹皮、赤芍等组成，其改善光损伤的机制尚未明确。本实验通过建立UVB辐射诱导的HaCaT细胞光损伤体外模型，以蒿秦化斑方高、中、低剂量进行干预，观察蒿秦化斑方对于UVB诱导的HaCaT细胞光损伤的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物

蒿秦化斑方汤剂，组方为青蒿30 g、生地黄15 g、水牛角15 g、秦艽10 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、防风15 g、生甘草6 g。由北京中医医院(供货方：北京盛世龙药业有限公司)提供。

1.2 主要器材与试剂

二氧化碳培养箱(MCO-15AC型，SANYO)，倒置显微镜(XDS-2B型，重庆光电)，超净台(SW-CJ-1D型，江苏通净)，分光光度计(NANODROP 2000，Therno scientific)，酶标仪(MultiSkan3，Therno scientific)，离心机(Centrifuge 5415D，Eppendorf)。

MEM α, Nucleosides(GIBCO，12571063)，EBSS(GIBCO，14155063)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(GIBCO，12664-025)，胰酶(锐尔康,REK3012)，磷酸缓冲液(锐尔康，REK3005)，MTT(GIBCO，v13145)。

1.3 细胞及其培养

HaCaT细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，在37℃,5% CO2, 95%湿度的二氧化碳培养箱中用含有10%FBS的1640培养基培养。待细胞密度增加至80%以上时，用0.25%胰酶消化，收集细胞。

1.4 细胞毒性的测定

HaCaT细胞按常规消化终止后用生长培养基调整细胞密度为1×105个/mL，100 μL/孔铺于96孔细胞培养板内，24小时后，分别更换含不同剂量(12.1、6.05、3.03 mg/mL)的蒿秦化斑方培养基作用细胞24小时，弃掉细胞原培养基，加入100 μL的1640培养基和10 μL的MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,噻唑蓝)溶液，37℃反应4小时后弃掉MTT反应液，用10%的十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate,SDS)充分溶解细胞，570 nm下读取吸光值，并计算细胞抑制率，选择细胞抑制率小于10%的剂量作为最大无毒剂量。进行光密度(optical density,OD)值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值，细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%。

在本研究中，默认同一批次的细胞之间没有个体差异，为了保证实验的可重复性，检测细胞增殖情况设计为6孔重复，可有效降低误差。

1.5 UVB照射与分组

将收集的细胞随机分为5组，A组空白对照组：HaCaT细胞正常培养；B组UVB模型组：HaCaT细胞用300 mJ的UVB刺激15分钟；C组中药高剂量组：300 mJ的UVB刺激HaCaT细胞15分钟后，加入对细胞抑制率小于10%的最大无毒剂量中药(此剂量记作C)，作用24小时；D组中药中剂量组：300 mJ的UVB刺激HaCaT细胞15分钟后，加入C/2剂量中药，作用24小时；E组中药低剂量组：300 mJ的UVB刺激HaCaT细胞15分钟后，加入C/4剂量中药，作用24小时。

1.6 MTT法检测细胞增殖

细胞模型结束后，弃掉细胞原培养基，加入100 μL的1640培养基和10 μL的MTT溶液，37℃反应4小时；弃掉MTT反应液，用10%SDS充分溶解细胞，490 nm下读取OD值，并计算细胞抑制率，观察各组对细胞细胞增殖的影响；细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%

1.7 吸光度法测定SOD、CAT活性和MDA含量

各组细胞中加入RIPA裂解液，4℃反应30分钟，离心后收集上清，进行定量后调整密度为2 mg/mL，根据制造商的说明书添加相应样品，7℃反应1小时；酶标仪450 nm下检测OD值，并计算SOD酶活性；测MDA含量时将标准曲线配制成2 mM 的MDA标准，分别加入0、2、4、6、8、10 μL溶于200 μL(ddH2O)，95℃、60分钟，冰浴10分钟后，酶标仪532 nm下检测OD值，并计算MDA含量。测CAT活性时将样本或阳性质控液加到每孔，调整总含量至78 μL，25℃，30分钟后，加入10 μL的终止液，25℃孵育5分钟，完全抑制样本中的过氧化氢酶活性，作为HC，配制1 mM的H2O2，分别加入0、2、4、6、8、10 μL的MmH2O2，调整至90 μL，加入10 μL的终止液，每孔加入50 μL混合，酶标仪570 nm下检测OD值并计算CAT活性。注：CAT活性以消耗等量的H2O2所需CAT的含量来测定，消耗等量的H2O2所需CAT含量越多说明CAT活性越低。

在本研究中，默认同一批次的细胞之间没有个体差异，为了保证实验的可重复性，每个样本设计3个复孔。

1.8ELISA检测细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、血管细胞间黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、内皮细胞选择素(endothelium-selectin,E-selectin)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、TGF-β的含量。

各组细胞根据实验分组分别处理，在450 nm下读取吸光值， 以标准品剂量和吸光值绘制标准曲线(4-PL曲线拟合)， 通过标准曲线计算样品中VCAM-1、 ICAM-1、 E-selectin、 IL-10、 TGF-β的含量。

在本研究中，默认同一批次的细胞之间没有个体差异，为了保证实验的可重复性，每个样本设计3个复孔。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 细胞毒性测定确定中药最大无毒剂量

对细胞毒性的测定发现，1.25%中药对细胞活性抑制率最低，对应的中药浓度为12.1 mg/mL，因此可以确定中药最大无毒剂量为12.1 mg/mL。见表1。

表1 不同浓度中药对HaCaT细胞的抑制率

2.2 MTT法测定HaCaT细胞增殖

与空白对照组比较，UVB模型组细胞增殖能力降低(P<0.05)。与UVB模型组比较，蒿秦化斑方高、中、低剂量组细胞增殖能力均增强(P<0.05)。见表2。

2.3 吸光度法检测SOD、CAT、MDA含量

通过吸光度法测定各组细胞中SOD、CAT的活性以及各组细胞中MDA的含量。与空白对照组比较，UVB模型组SOD表达降低(P<0.05)；与UVB模型组比较，蒿秦化斑方高剂量组SOD表达增多(P<0.05)。与空白对照组比较，UVB模型组分解1 μmol的H2O2所需的CAT量升高，CAT活性降低(P<0.01)；与UVB模型组比较，蒿秦化斑方高剂量组分解1 μmol的H2O2所需CAT量减少，CAT活性增强(P<0.05)。与空白对照组比较，UVB模型组MDA含量增加(P<0.05)；与UVB模型组比较，蒿秦化斑方高剂量组MDA含量降低(P<0.05)。见表3。

表2 高中低浓度中药组给药后HaCaT 细胞增殖水平比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.05；与UVB模型组比较，bP<0.05。

2.4 ELISA法检测ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β、IL-10的含量

与空白对照组比较，UVB模型组ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-10表达增多(P<0.05)，TGF-β表达降低(P<0.05)；与UVB模型组比较，蒿秦化斑方高剂量组ICAM-1表达增多(P<0.05)，蒿秦化斑方中、低剂量组ICAM-1表达无统计学差异(P>0.05)，蒿秦化斑方高、中、低剂量组VCAM-1、E-selectin、IL-10表达均增多(P<0.05)，TGF-β表达均降低(P<0.05)。见表4。

表3 高中低浓度中药组给药后HaCaT细胞SOD、CAT、MDA含量比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.05；与UVB模型组比较，bP<0.05。

表4 高中低浓度中药组给药后HaCaT细胞ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β、IL-10含量比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.05；与UVB模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

UVB照射引起的光损伤，中医称之为“日晒疮”，《外科启玄》对日晒疮有如下记载：“三伏炎天，勤苦之人，劳于任务，不惜身命，受酷日晒曝，先疼后破而成疮着，非血气所生也。”本病是由于强烈日光照射所致，以在曝晒处皮肤发生红斑、水肿或水疱等损害为临床表现，治疗中以清热除湿，凉血解毒为主[5]。 蒿秦化斑方具有清热解毒、 凉血化斑之效。既往研究证明以青蒿、赤芍等清热凉血解毒之品为主要组成成分的中药抗光敏合剂可明显改善皮肤光损伤[6]。因此，探讨蒿秦化斑方对HaCaT细胞的光损伤影响及其可能作用机制有积极意义。

青蒿苦寒清热，具有清热凉血的功效。惠海英等[7]发现青蒿素可通过抑制炎性因子的产生对UVB所致光损伤起到保护作用。秦艽、水牛角、生地黄具有凉血消斑的功效。秦艽主要成分龙胆苦苷和獐牙菜苦苷具有抗炎作用[8]。生地黄有效成分梓醇具有抗氧化、抗炎作用[9]。丹皮、赤芍、防风共奏祛风凉血止痒之效。丹皮酚具有抗皮肤过敏、抗炎的作用[10]。赤芍中没食子酸丙酯可通过增强SOD活性，降低MDA量发挥抗氧化作用[11]。防风辛温发散，善于祛风止痒,防风多糖的抗氧化、抗炎特性得到了证实[12]。生甘草清热解毒，调和诸药，甘草总黄酮可通过降低MDA量，增强SOD活性，清除自由基以发挥到抗氧化的作用[13]。

在本研究中，通过建立HaCaT细胞UVB光损伤体外模型，检测蒿秦化斑方对HaCaT细胞增殖、抗氧化防御能力标志物(SOD、CAT)、氧化产物MDA和炎症因子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β和IL-10)表达情况。本实验中模型组细胞增殖能力降低，抗氧化酶活性降低，氧化产物增多，炎症因子表达增多，提示成功建立HaCaT细胞光损伤模型。

UVB通过诱导减少内源性抗氧化剂(SOD、CAT)来促进氧化应激[14]。UVB照射引发的氧化应激是过量自由基降低SOD和CAT的活性，破坏自由基和抗氧化酶之间的平衡，脂质过氧化物MDA过度积累的过程，MDA的细胞毒活性能够加剧氧化损伤[15]。SOD和CAT的活性、MDA含量是评价HaCaT细胞氧化损伤的重要指标。结果显示在UVB照射后抗氧化剂SOD和CAT活性下降，而氧化产物MDA的含量增加，蒿秦化斑方高剂量组的SOD和CAT活性增强，MDA含量降低。中、低剂量组SOD和CAT活性、MDA含量没有变化，提示高剂量蒿秦化斑方可以通过增强抗氧化酶(SOD、CAT)活性，降低氧化终产物MDA水平，改善氧化损伤。近期发现虫草中分离的抗氧化物能够通过增强SOD活性，降低MDA的含量，清除自由基，修复UVB诱导的氧化损伤[16]。二氢咖啡酸可以通过增强CAT的活性来减弱UVB照射造成的氧化损伤[17]，这与课题组的研究结果一致。

UVB辐射影响免疫和炎症反应的过程[18]。VCAM-1、ICAM-1、E-selectin是皮肤炎症和免疫刺激相关分子。据报道，系统性红斑狼疮、多形性日光疹皮肤中这些粘附分子表达上调[19]。燕华玲等[20]发现，多形性日光疹患者血清中ICAM-1和E-selectin表达显著升高。VCAM-1作为炎性介质介导免疫反应的同时促使炎症级联放大[21]。UVB照射使IL-10产生增加，IL-10可抑制局部免疫反应，如接触性超敏反应和延迟型超敏反应[22]。VCAM-1、ICAM-1、E-selectin和IL-10可以作为表征细胞免疫和炎症反应的重要指标。结果显示，UVB照射后VCAM-1、ICAM-1和E-selectin含量均升高，蒿秦化斑方高剂量组ICAM-1含量降低，蒿秦化斑方中、低剂量对ICAM-1的含量没有影响。蒿秦化斑方高、中、低剂量组VCAM-1和E-selectin的含量均降低，研究说明高剂量蒿秦化斑方能够抑制炎症因子的表达，改善UVB诱导的HaCaT细胞的免疫和炎症反应。

UVB诱导的氧化应激和炎症，最终会导致皮肤屏障结构受损，形成难以愈合的伤口，细胞增殖和胶原蛋白的合成能够修复皮肤屏障[23]。TGF-β具有组织修复作用，能够调节胶原蛋白的稳态[24]，研究发现[25]，脂质介体雷索文D1通过增加TGF-β的表达对UVB照射引起的皮肤炎症和氧化应激有明显改善作用。研究显示，UVB照射抑制了HaCaT细胞的增殖和TGF-β的表达，蒿秦化斑方高、中、低剂量组均能促进HaCaT细胞的增殖，促进TGF-β的产生。提示蒿秦化斑方可以通过细胞增殖和胶原蛋白的重组修复受损细胞。

综上所述，高剂量蒿秦化斑方能够改善UVB诱导的HaCaT细胞光损伤，其作用机制可能与以下三个方面有关：抑制氧化应激，下调炎症因子的表达，修复细胞屏障功能。这三方面共同起到保护HaCaT细胞免受光损伤的作用。