头顶一颗珠正丁醇萃取物对人肝癌HepG2细胞的抑制作用及其对MMP-9、NF-κB p65的表达研究

彭金香 吴沣 詹康 张棽 詹光杰

头顶一颗珠(TrilliumTschonoskiiMaxim，TTM)别名为延龄草，来源于百合科，为延陵草属，吉林延龄草的根及根茎[1]，其主要成分为皂苷[2]，主治高血压病、月经不调、外伤导致的出血等病症。目前，头顶一颗珠抗肿瘤作用主要集中在结肠癌、肺癌、宫颈癌等方面[3]，专家研究发现头顶一颗珠对肝有明显的保护作用[4]。詹光杰等[5]研究发现，头顶一颗珠有抗炎护肝的功能。宋秀三等[6]研究证明，头顶一颗珠可促进T细胞成熟和迁移。本次实验目的是观察头顶一颗珠正丁醇萃取物对人肝癌HepG2细胞的增殖凋亡是否存在影响，通过检测基质金属蛋白酶-9(matrix metallo proteinases-9，MMP-9)、核转录因子-κB p65(nuclear factor κB p65，NF-κB p65)的表达情况，试探讨其在肝癌治疗中的作用机制及其可行性。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人肝癌细胞 HepG2(上海慧颖生物科技有限公司)，5%CO2，温度37 ℃的培养箱中进行培养。

1.2 实验药品与试剂

头顶一颗珠原药材购买于恩施板桥药材生产基地，经鉴定为头顶一颗珠。首先进行低温60℃，干燥24小时。适量75%乙浸泡处理头顶一颗珠药粉1小时，回流，即得头顶一颗珠醇提取液，减压干燥，即乙醇提取物。随后再用提取药物专用水溶解，用正丁醇萃取[7]。减压条件下，浓缩、干燥，即得头顶一颗珠原药材正丁醇萃取物。测得头顶一颗珠正丁醇萃取物总皂苷含量为14.26 mg/g。含量测定仪器是紫外分光光度计，北纳创联生物头顶一颗珠为其对照品。DMEM培养基(SH30243.01B)，NF-κB试剂盒(Shanghai blue sky，SN368)，PCR试剂(TOYOBO)。

1.3 实验仪器

CO2培养箱(日本三洋MCO-18AIC)，全波长酶标仪(美国Thermo公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，SG超纯水器(德国)，酶联免疫检测仪(美国RT-2100C)，超低温冰箱(日本MDFU4086S)，紫外分光光度计(美国Beckman公司)，干燥箱(中国DZ-2BC Ⅳ), 高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)，流式细胞仪(美国 Beckman公司)。

1.4 引物设计

实验的所有基因数据都是按照 Pubmed数据库以及β-actin基因序列为标准，均收集头顶一颗珠原药材正丁醇萃取物(6 μmol/L)处理HepG2细胞48小时之后，进行检测，以β-actin为内参。

1.5 HepG2细胞的抑制率测定

首先将人肝癌细胞HepG2接种至96孔板，再分别用5组头顶一颗珠正丁醇萃取物(6、12、24、48、96) μmol/L分别作用于HepG2，头顶一颗珠正丁醇萃取物的空白对照组为0 μmol/L组。本次研究使用CCK8 法，对5个浓度组与其0 μmol/L的空白对照组进行比较，计算出HepG2细胞的抑制率。

1.6 MMP-9、NF-κB p65表达水平的测定

4组头顶一颗珠正丁醇萃取物(3、6、12、24 μmol/L)分别作用于HepG2细胞48小时后，空白对照组为0 μmol/L组，用qPCR检测MMP-9、NF-κB p65的表达水平。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 荧光定量结果

根据Pubmed数据库，以及β-actin基因序列为参照,分别收集头顶一颗珠原药材正丁醇萃取物(6 μmol/L)处理HepG2细胞48小时之后，以β-actin作为本次实验的内参，所得引物序列及其扩增片段见表1。采用Primer 5.0软件，运用qPCR检测，其引物扩增曲线、引物熔解曲线见图1。从表1发现MMP-9、NF-κB p65、β-actin表达情况较好，图1显示MMP-9、NF-κB p65、β-actin的溶解曲线都是单峰，反应扩增产物单一，引物有很强的特异性，即确定为目标产物。

表1 PCR引物序列

2.2 CCK-8检测头顶一颗珠正丁醇萃取物对肝癌HepG2细胞抑制情况

不同浓度的头顶一颗珠正丁醇萃取物(6、12、24、48、96)μmol/L作用于HepG2细胞不同时间，与0 μmol/L的头顶一颗珠正丁醇萃取物进行比较，证明HepG2细胞生长增殖情况均受到不同浓度的头顶一颗珠明显抑制(P<0.01)。在其中同一时间点，随着药物浓度的不断增加，HepG2细胞抑制率呈剂量的相关性，即头顶一颗珠药物浓度越高，头顶一颗珠对HepG2细胞抑制率越高，其抑制率且与浓度及时间呈依赖性。见表2。

2.3 qPCR检测MMP-9、NF-κB p65的表达水平

与0 μmol/L的头顶一颗珠正丁醇萃取物比较，MMP-9、NF-κB p65均明显降低(P<0.01)，并且随着头顶一颗珠正丁醇萃取物浓度的增加，MMP-9、NF-κB p65的表达水平不断降低(P<0.05)，表明头顶一颗珠正丁醇萃取物能显著抑制MMP-9、NF-κB p65表达及活性，且呈剂量依赖性。见表3。

注：A：β-actin的扩增曲线；B：β-actin的溶解曲线；C：MMP-9的扩增曲线；D：MMP-9的溶解曲线；E：NF-κB p65的扩增曲线；F：NF-κB p65的溶解曲线。

图1 内参基因及目的基因扩增曲线和溶解曲线

表2 多浓度头顶一颗珠正丁醇萃取物处理 HepG2细胞后的抑制率情况比较

注： 同一作用时间下，与前一浓度组比较，P均<0.05。

表3 多浓度头顶一颗珠正丁醇萃取物处理HepG2后 MMP-9、NF-κB p65表达水平检测结果比较

注： 与0 μmol/L比较，P均<0.05；后浓度组与前浓度组比较，P均<0.05。

3 讨论

NF-κB信号通路在原发性肝癌细胞的侵袭转移过程中起着关键作用[8]。当NF-κB在某种条件下被激活以后，NF-κB通路常在体内以p65 的形式存在，它将参与到许多基因转录的调节。MMPs在各种肿瘤发生、浸润、转移一系列过程中，发挥特别关键的功能。MMP-9是MMPs蛋白家族最重要的胶原酶之一，MMP-9与多种肿瘤的生长、侵袭、转移有着不可分割的联系。

目前研究发现MMP-9存在于肝癌的表达中，还跟各种肿瘤有着侵袭与转移的关系[9]。TANG 等[10]研究发现，肝癌细胞组织的14-3-3β蛋白，其表达会激活NF-κB信号通路，进而上调MMP-9的表达。CHEN 等[11]研究表明，迁移和入侵是各种肿瘤转移的主要特征，MMP-9在各种癌症的侵袭、扩散、转移过程中，扮演重要的角色，主要是抑制NF-κB信号通路。还有研究证明，NF-κB是调节MMP-9表达的关键转录因子，可上调MMP-9的表达。这些效应促进肝癌细胞对细胞外基质的降解，最终导致肝癌细胞不断向四周侵袭与转移。

本次结果证明，头顶一颗珠正丁醇萃取物处理的HepG2细胞被抑制增殖，其抑制率跟细胞培养时间和药物浓度呈依赖性。5种不同浓度均能显著抑制两种基因的表达水平，随头顶一颗珠提取物浓度不断增大，两种基因的表达水平不断降低。目前，对于MMP-9在肝癌方面的研究比较局限，机制也不是很明确；还需要进一步的研究和探讨。本次实验存在的不足：未观察细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax比值，没有分析头顶一颗珠正丁醇。下一步需要重点研究抑制HepG2细胞增殖的机制，并对NF-κB p65与MMP-9 mRNA之间关系的进行深层次研究。