微小RNA-497在麝香保心丸治疗AMI后心室重构中的作用研究

钟春荣，符传艺，张捷君，符武岛

(海南省人民医院 1.医疗保健中心四区，2.神经介入科，3.医疗保健中心三区，海南 海口 570311)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉急性缺血缺氧引起的心肌坏死，临床表现为剧烈而持久的胸骨后疼痛、血清肌钙蛋白Ⅰ(troponin I，TnI)、肌红蛋白(myoglobin，MB)、肌酸激酶同功酶(creatine kinase isoenzyme，CKMB)等心肌酶活性增高，以及心电图进行性改变，可累及消化、呼吸、心血管系统，并发心律失常、心脏破裂、心力衰竭、血管栓塞、心源性休克等，危及生命[1]。AMI后心室重构是引起心力衰竭的主要原因，目前临床尚无治愈心力衰竭的方法，因此探索AMI后心室重构的新治疗方法成为当务之急[2]。麝香保心丸是一种具有改善血流动力学、缓解心绞痛、改善心肌缺血作用的中成药，已成功应用于心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的治疗[3]。微小RNA-497(Microrna-497，miRNA-497)是一种单链非编码小RNA分子，可参与转录后基因表达调控[4]。有研究显示[5]miRNA-497对AMI后心室重构具有调控作用。麝香保心丸对AMI后心室重构具有改善作用已有文献报道[6]，但麝香保心丸改善AMI后心室重构的分子学基础是否为miRNA-497尚不清楚。本研究就miRNA-497在麝香保心丸改善AMI后心室重构中的作用进行了探讨，以期明确miRNA-497与麝香保心丸改善AMI后心室重构的关系，鉴定麝香保心丸改善AMI后心室重构的分子基础，为AMI后心室重构的治疗提供新的可能方案，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SD大鼠90只，SPF级，雄性，体质量(320±20)g,购于上海抗体药物国家工程研究中心有限公司，生产许可：SYXK(沪)2018-0041。将90只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、miRNA-497激动剂+麝香保心丸组、麝香保心丸组、miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组、miRNA-497抑制剂组，每组15只(注：miRNA-497激动剂是模拟生物体内源的miRNA-497，运用化学合成的方法合成，能够增强内源性miRNA-497的功能，而miRNA-497抑制剂是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA-497的抑制剂)。

1.2 造模及干预方法

采用结扎左冠状动脉前降支法制备急性心肌梗死大鼠模型，方法如下：腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠溶液(天津兰洪新能源科技有限公司)麻醉大鼠，剪去胸部被毛并消毒，于胸骨左缘第2肋～4肋开胸，结扎冠脉左前降支，当结扎区域变白，心电图ST段弓背上抬为造模成功。假手术组仅分离前室间支，不结扎。模型组、miRNA-497激动剂+麝香保心丸组、麝香保心丸组、miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组造模成功后，模型组给予等量生理盐水(上海艾研生物科技有限公司)，miRNA-497激动剂+麝香保心丸组尾静脉注射miRNA-497激动剂[4](15 mg/kg，每天1次，连续3天，广州锐博生物有限公司)和灌胃麝香保心丸(15 mg/kg，每天1次，连续6周，上海和黄药业有限公司)，麝香保心丸组给予麝香保心丸(15 mg/kg，每天1次，连续6周，上海和黄药业有限公司)灌胃，miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组尾静脉注射miRNA-497抑制剂[4](15 mg/kg，1次/天，连续3天，广州锐博生物有限公司)和灌胃麝香保心丸(15 mg/kg，1次/天，连续6周，上海和黄药业有限公司)，miRNA-497抑制剂组尾静脉注射miRNA-497抑制剂(15 mg/kg，每天1次，连续3天，广州锐博生物有限公司)。

1.3 观察项目

①各组大鼠一般情况：6周后观察大鼠精神状态、反应、进食、饮水、运动、死亡等一般情况并记录。②各组大鼠心功能指标：麻醉各组大鼠，行右侧颈总动脉插管(将连接压力换能器的插管经右侧颈总动脉逆行插入左心室)，通过PowerLab生物信号采集与分析系统(香港友诚生物科技有限公司)，测定并记录左室收缩末压(left ventricular end systolic pressure，LVESP)、左室内压最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室内压最大下降速率(LV-dp/dtmax)。③各组大鼠急性心肌梗死面积：将各组大鼠处死，摘取心脏，左心室部分称重后切成1～1.5 mm心肌薄片，将心肌薄片置于1% 2,3,5氯化三苯基四氮唑溶液(北京索莱宝科技有限公司)中，37 ℃避光孵育10 min，用滤纸吸干，称重，梗死区域呈白色，非梗死区域呈红色，切下梗死区称重，急性心肌梗死面积=(急性心肌梗死重量/左心室重量)×100%[7]。④各组大鼠心肌组织形态学变化：取各组大鼠心肌组织，固定，脱水，透明，包埋，切片，脱蜡，脱水，伊红-苏木素(eosin-hematoxylin，HE)染色试剂盒(上海威奥生物科技有限公司)染色，脱水，透明，封片，光学显微镜(重庆奥特光学显微镜有限公司，型号：MDS400)下观察心肌组织形态学变化。⑤各组大鼠心肌细胞凋亡率：取各组大鼠心肌组织，剪碎，匀浆，裂解，消化、传代，取第3代心肌细胞，制备细胞悬液，细胞悬液的细胞计数为1×106个，取1支洁净流式管，依次加入100 μL细胞悬液、5 μL异硫氰酸荧光素(天津希恩思生化科技有限公司)、5 μL碘化丙啶(武汉艾美捷科技有限公司)，充分混匀，25 ℃避光反应15 min，采用流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号：FACSCalibur)检测心肌细胞凋亡率。⑥各组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量：取各组大鼠心肌组织，液氮研磨，提取总RNA，将总RNA逆转录成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增，根据扩增曲线读取循环数(Ct)，将GAPDH作为内参基因，采用相对定量法以2-△△Ct对miRNA-497表达水平进行相对定量分析(图1)。

图1 琼脂糖凝胶电泳图1：MarkerDL2000；2、3、4：内参基因扩增条带；5、6、7：目的基因扩增条带

1.4 统计学方法

数据采用SPSS22.0软件统计分析，两两计量资料比较采用snk-q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况

假手术组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等均良好，未出现死亡大鼠；模型组大鼠呈现病态特征，精神萎靡，被毛粗糙不整齐，不思饮食，捕捉无抵抗现象，4只大鼠死亡；麝香保心丸组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等较模型组明显好转，2只大鼠死亡；miRNA-497激动剂+麝香保心丸组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等较麝香保心丸组明显异常，3只大鼠死亡；miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等较麝香保心丸组明显好转，1只大鼠死亡；miRNA-497抑制剂组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等较miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组无明显差别，1只大鼠死亡。

2.2 各组大鼠心肌组织形态学变化

假手术组大鼠心肌组织排列整齐，横纹清晰，无变性坏死，未见纤维化，间质无充血肿胀，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌组织排列紊乱，横纹不清，心肌细胞肥大，有大量点状坏死灶，成纤维细胞大量增生，大量胶原纤维取代心肌细胞，纤维化明显，间质明显充血肿胀，炎性细胞浸润明显；麝香保心丸组心肌组织病理改变较模型组明显改善；miRNA-497激动剂+麝香保心丸组心肌组织病理改变较麝香保心丸组明显加重；miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组心肌组织病理改变较麝香保心丸组明显改善；miRNA-497抑制剂组心肌组织病理改变较miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组无明显差别(图2)。

图2 各组大鼠心肌组织形态学变化(HE染色，200×)A：假手术组；B：模型组；C：miRNA-497激动剂+麝香保心丸组；D：麝香保心丸组；E：miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组；F：miRNA-497抑制剂组

2.3 各组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率

模型组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率显著高于假手术组(P<0.05)；麝香保心丸组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率显著低于模型组(P<0.05)；miRNA-497激动剂+麝香保心丸组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率显著高于麝香保心丸组(P<0.05)；miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率显著低于麝香保心丸组(P<0.05)；miRNA-497抑制剂组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率较miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组无显著差异(图3，表1)。

表1 各组大鼠急性心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率 (%)

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况A：假手术组；B：模型组；C：miRNA-497激动剂+麝香保心丸组；D：麝香保心丸组；E：miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组；F：miRNA-497抑制剂组注：横坐标表示Annexin V/FITC染色，纵坐标表示PI染色，Q1象限表示机械性死亡细胞，Q2象限表示凋亡晚期的细胞，Q4象限表示正常活细胞，Q3象限表示凋亡早期的细胞

2.4 各组大鼠心功能指标

模型组大鼠LVEDP显著高于假手术组(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax显著低于假手术组(P<0.05)；麝香保心丸组大鼠LVEDP显著低于模型组(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax显著高于模型组(P<0.05)；miRNA-497激动剂+麝香保心丸组大鼠LVEDP显著高于麝香保心丸组(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax显著低于麝香保心丸组(P<0.05)；miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组大鼠LVEDP显著低于麝香保心丸组(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax显著高于麝香保心丸组(P<0.05)；miRNA-497抑制剂组大鼠LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax较miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组无显著差异(P>0.05，表2)。

表2 各组大鼠心功能指标

2.5 各组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量

模型组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量显著高于假手术组(P<0.05)；麝香保心丸组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量显著低于模型组(P<0.05)；miRNA-497激动剂+麝香保心丸组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量显著高于麝香保心丸组(P<0.05)；miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量显著低于麝香保心丸组(P<0.05)；miRNA-497抑制剂组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量较miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组无显著差异(P>0.05，表3)。

表3 各组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量

3 讨 论

心肌梗死属于中医“胸痹”、“厥心痛”“心痛”、“卒心痛”等范畴，心室重构在中医中无相同病名，但就其心悸、头晕、喘憋、咳嗽、胸闷、胸痛、咯痰、乏力、恶心、腹胀、水肿等心衰症状来说，当属中医“心悸”、“喘证”、“胸痹”、“水肿”等范畴[8-9]。中医药治疗为一种多靶点、多途径的治疗方式，临床逐渐应用于AMI治疗。麝香保心丸是一种中成药，由人工麝香、人工牛黄、蟾酥、冰片、苏合香脂、肉桂、人生提取物组成，具有扩张冠状动脉、改善血流动力学、缓解心绞痛、降低血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)、稳定易损斑块、调节心肌间质胶原表达、减少梗死心肌面积、抑制血管壁炎性、预防心室重构、改善心肌缺血作用，现已成功应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)、AMI等CVD的治疗，被列为全国中医医院急诊科室首批必备中成药[10-11]。本研究显示模型组大鼠一般情况、心肌组织形态变化较假手术组明显异常，提示造模成功。本研究显示麝香保心丸组大鼠一般情况、心肌组织病理学改变、LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax、急性心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率较模型组显著改善，这与杨波等[6]研究结果一致，提示麝香保心丸能够改善急性心肌梗死后心室重构，可能是由于心肌梗死后心室重构多见气虚血瘀，多属本虚标实，这与麝香保心丸的温通胸阳、活血化瘀、益气养心方证相合。

miRNA是一类广泛存在于真核生物中的单链非编码小分子RNA，长度约为20～25个核苷酸，能够通过靶向结合特定mRNA的3′端非编码区(3′UTR)，促使mRNA降解，抑制mRNA进一步翻译蛋白，从而对靶基因表达进行转录后负调控。miRNA-497为miRNA中的一种，已有研究证实miRNA-497在疾病组织中表达异常，且具有调节细胞增殖、分化、凋亡的作用[12]。有研究发现[13]miRNA-497可通过负性调节B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell leukemia-2，Bcl-2)而发挥促进缺血性神经元调亡的作用。有研究报道[14]miRNA-497在缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury，IRI)过程中异常表达。既往资料显示[15]miRNA-497在AMI大鼠心脏中表达明显上调，敲低miRNA-497可减少AMI大鼠心肌梗死面积和心肌细胞凋亡，增强自噬(autophagy)流。上述研究[13,15]在本研究中也得到了证实，本研究显示miRNA-497抑制剂组各项指标较miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组无显著差异，提示miRNA-497是麝香保心丸改善急性心肌梗死后心室重构中的关键分子。本研究显示miRNA-497激动剂+麝香保心丸组各项指标较麝香保心丸组明显异常，miRNA-497抑制剂+麝香保心丸组各项指标较麝香保心丸组有显著改善，麝香保心丸可能通过抑制miRNA-497表达而改善大鼠急性心肌梗死后心室重构，这可为急性心肌梗死后心室重构发掘出新药研发靶点。

综上所述，miRNA-497是麝香保心丸改善急性心肌梗死后心室重构中的关键分子，这为急性心肌梗死后心室重构提供新的研究方向。