针灸调冲任法对输卵管炎性不孕大鼠NF-κB、TNF-a蛋白表达的影响

聂婷

（安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥）

0 引言

近年来随着环境的改变及妇科宫腔操作的增多,女性不孕的发病率呈逐年上升趋势,其中慢性输卵管炎性病变导致的不孕约占1/3 左右。现代研究发现，此过程是由多种炎症因子参与的输卵管管壁、内膜、纤毛的慢性炎症性病变，可致输卵管积水、化脓及与周围组织粘连，阻碍精卵结合与运送，而致不孕。故抑制炎症反应、恢复输卵管功能，是治疗输卵管炎性不孕的关键。西医多用抗生素、腹腔镜、辅助生殖技术等，但费用高、易复发。我课题组通过多年的临床观察发现：针灸调冲任法治疗输卵管炎性不孕疗效确切[1-3]。本研究旨在用针灸调冲任法干预输卵管炎性不孕大鼠，探究其治疗疾病的机制，进一步指导临床。现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物

购置成熟的84 只Wistar 雌性大鼠，体重约（200±20）g，鼠龄在8周-12周。由安徽中医药大学动物房饲养，保持室温、自然光照周期。

1.2 主要实验药品、试剂

1.2.1 药物

庆大霉素，广东三才石岐制药股份有限公司，国药准字H44023277。

1.2.2 试剂

大肠杆菌：菌号FSCC149006 ；金黄色葡萄球菌：菌号 FSCC223005；溶血性链球菌：菌号FSCC225002，以上购自北京东方赛瑞生物技术有限公司，由安徽中医药大学细菌室培养。混合菌悬液浓度为3×109/mL（由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，按2:1:1 以无菌注射用水稀释）。水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号20160709。NF-κB、TNF-a 试剂盒均购买于武汉博士德生物工程有限公司。

2 实验方法

2.1 造模方法

所有大鼠适应性饲养1周后称重、编号，用随机数字表法取20 只作为正常组，剩余64 只造模。使用3%戊巴比妥钠50mg/kg 对大鼠进行腹腔注射予以麻醉，待药物起效后放于手术台上，在脊柱旁两侧进行剃毛，使用碘伏消毒皮肤，在脊柱侧旁开1cm 行横切口，打开腹腔后，寻找输卵管和卵巢，将一侧输卵管和卵巢组织充分暴露在腹腔外，然后将配置好的混合菌悬液0.1mL 注射到输卵管中，再逐层缝合肌层和皮肤。采用同种方法对另侧进行处理，手术完毕后常规消毒皮肤，将造模后的大鼠放于鼠笼内，等待苏醒。分别于造模后第15、20d 各取材两只，观察输卵管炎症情况，判断造模成功与否。

2.2 实验分组

将造模成功的60 只大鼠随机分为3 组：针灸组20 只、西药组20 只、模型组20 只。加上正常组20 只，共4 组。

2.3 干预方法

在给药剂量上，按人和大鼠体表面积折算的剂量给药，针刺的穴位按照参考《实验针灸学》及动物比较学方法定位。

1）正常值:正常喂养，灌服生理盐水，1.8mL/kg·d，灌服20 天。

2）模型组：造模后，正常喂养，灌服生理盐水，1.8mL/kg·d，灌服20 天。

3）西药组：造模后，灌服庆大霉素0.72 万U/kg·d ，灌服 20 天。

4）针灸治疗组：造模后，选用苏州天协针灸器械有限公司生产的天协牌1 寸针灸针以及苏州医疗用品厂有限公司生产的清艾条，针灸气海、中极、关元、中注穴。进针约2mm，轻度捻转，得气后留针 30min，期间更换艾条，1 次/d，针灸 20 天。

以上大鼠治疗20 天后禁食水24H，水合氯醛麻醉，脱臼处死。取出双侧输卵管，剔除周围脂肪组织，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定，进行免疫组化观察蛋白含量。

2.4 统计方法

使用 SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，计数资料等级资料采用Wilcoxon 秩和检验，计数资料样本率的比较用χ2检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

与正常组比较，模型组NF-κB、TNF-a 表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，针灸组与西药组NF-κB、TNF-a 表达强度的差异有统计学意义（P＜0.05）。与西药组比较，针灸组NF-κB、TNF-a 表达强度的差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1-表2。

表1 各组大鼠输卵管组织中NF-κB 蛋白表达的比较

表2 各组大鼠输卵管组织中TNF-a 蛋白表达的比较

4 讨论

清代陈士铎在《石室秘录》中提到：“任督之间，倘有疝瘕之症，则精不能施，因外有所障。”提示古代医家已经意识到病理性阻塞导致的受精障碍是导致不孕的一种病因。输卵管炎性不孕的中医学发病机理可概括为：摄生不慎，邪入血脉并搏结成瘀，阻滞冲任、胞宫，使阴阳二精难以相搏成孕。其病机关键为冲任瘀阻，治疗大法以调理冲任，活血化瘀为主。大量临床研究证实，针灸对盆腔炎症性疾病疗效显著[4-5]。我们选取气海、关元、中极均属任脉经穴，关元是肝脾肾三经与任脉交会穴，与胞宫相连接，同时与冲任相互联系，可固本培元、补益下焦、疏通冲任二脉，《针灸大成》云：“关元主月经不通，绝嗣不生”；气海穴是“人之元气所生也”，可引气归元，通过调节气机，改善局部血液循环、新陈代谢；中极穴是“足三阴、任脉之会”，通于胞宫,可调理冲任，培元益精、补肾调经、清热利湿；中注属足少阴肾经的穴位，是冲脉交会穴，可疏通经气，调理气机。艾灸[6]可通过刺激穴位、经络，使局部小血管扩张，促进局部血液循环，温湿化瘀，行气消癥而抑制炎性反应。二者合用，共奏活血化瘀、通调冲任之功。

本实验结果表明：针灸调冲任法能够抑制NF-κB、TNF-a 蛋白的表达，效果等于西药组。NF-κB、TNF-a 均是TLR4 级联反应的下游分子，其中NF-κB 是炎症级联反应的重要始动因素，可通过诱导特定基因表达, 激活细胞因子级联反应。既往研究表明：NF-κB 可诱导IL-1、细胞间粘附分子、TNF-a 等炎症因子的表达，促使白细胞向血管内皮细胞移动、粘附并渗出，参与炎症反应。另外肿瘤坏死因子、白介素等细胞因子的表达反过来亦增加NF-κB 的表达，从而进一步加重炎症反应，形成恶性循环。TNF-a 主要由巨噬细胞合成和分泌，有着多种生物活性的细胞激动剂，研究表明TNF-a 与输卵管炎密切有关[7]。其主要作用是介导输卵管上皮细胞凋亡，炎症发生时刺激巨噬细胞分泌和释放TNF-a 含量增多，诱导炎性细胞释放毒性物，刺激成纤维细胞增生，促进胶原酶释放，且水平越高损伤越重[8]。

以上研究表明：针灸调冲任法可通过抑制NF-κB 、TNF-a 蛋白的表达来抑制炎症反应，达到受孕的目的，是治疗输卵管炎性不孕的有效方法，且操作简单、价格低廉，值得临床推广。