瞬时受体电位香草酸亚型1基因多态性与小儿哮喘的关系

周 毅 刘卫红 侯梅荣

哮喘是一种以慢性气道炎症、气道高反应性为主要特征的变态反应性疾病，多种细胞、炎性介质及细胞因子共同参与发病过程，尤其好发于儿童时期。随着城市化进程的加快与生态环境的不断恶化，近年来国内各医院哮喘患儿不断增加，不仅影响儿童的正常生长发育，亦可对其身心健康产生负面影响[1]。同时，随着对哮喘发病机制的深入研究，越来越多的学者认为此病与多基因遗传相关，调查显示其遗传度达48%～79%[2]。因此，从遗传学角度预测哮喘易感体质，筛查哮喘高危儿童及针对性早期干预措施是目前研究的主要方向之一。瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)基因定位于人类17p13染色体，早期国内报道[3]显示，该基因多态性与儿童非特异性慢性咳嗽、喘息密切相关，国外亦有学者[4]证实TRPV1及相关细胞因子与支气管哮喘有一定关系。在此背景下，笔者拟进一步分析TRPV1多态性与小儿哮喘的关系，以期为小儿哮喘的病因研究、临床筛查及干预提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 抽取2018年2～10月平顶山市第一人民医院住院部及门诊的90例哮喘患儿为研究对象(哮喘组)，男性50例，女性40例，年龄3～14岁，平均(9.72±3.05)岁，病程1个月～5年，平均(3.21±1.06)年。纳入标准：①年龄3～15岁；②结合肺部听诊、肺功能检查、实验室检查等确诊，符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组于《支气管哮喘控制的中国专家共识(2013)》[5]中确定的儿童哮喘诊断标准；③过敏原特异性IgE抗体筛查证实有过敏原；④抗哮喘药物诊断性治疗有效。排除标准：①严重上呼吸道感染、肺炎、结核引起的慢性咳嗽以及气管异物、鼻后滴漏综合征等引起的支气管症状；②合并呼吸衰竭等其他呼吸系统疾病；③合并先天性心肺疾病、自身免疫性疾病及遗传性疾病；④合并有慢性消耗性疾病、内分泌、遗传代谢性疾病及长期或重症营养不良；⑤临床病历资料不全。另选取同期50例入院体检的健康儿童作为对照(对照组)，男性30例，女性20例，年龄4～15岁，平均(9.53±2.88)岁。两组研究对象性别构成、年龄均衡可比(P>0.05)。本研究通过了医院伦理委员会审核。

1.2 研究方法 ①制备模板DNA：所有入选对象抽取静脉血2 mL，肝素钠抗凝，常规离心处理，取200 μL血浆用全血基因组DNA提取试剂盒(上海生物工程有限公司)制备基因组DNA模板，操作步骤按说明书要求进行。②引物设计与合成：通过 GeneBank查找和调取TRPV1 3’-UTR目的基因序列，借助Primer premier 5软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成。包括rs222747位点(上游引物 5’-CAGAGACAGAGGGAGTTTGGA-3’，下游引物5’-ACACACAGGCGACGCCA-3’)、rs222748位点(上游引物：5’-TGCTGTCCCAGGACTCTGT-3’，下游引物5’-AGGATCCCAGAGAAGCAAGGA-3’)及rs8065080位点(上游引物5’-CAAGTCCTGGAGCTCATTTCA-3’，下游引物5’-GCCCTGACCCAGGTATGTGTA-3’)的基因型和等位基因。③聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)反应条件：PCR扩增应用PCR(Taq)扩增试剂盒(日本Takara公司)，浓度10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，总反应体系均为25 μL；条件：加热94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s(rs222747)/56℃退火30 s(rs222748)/62℃退火30 s(rs8065080)，72℃延伸1 min，30个循环，72℃再延伸5 min。PCR产物长度：rs222747为487 bp、rs222748为486 bp、rs8065080为486 bp。④基因型判断：经2%的琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像系统下观察及判断基因型(CC、GC、GG、TC、TT等)。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 19.0分析和处理研究数据，计数资料采取率表示，组间基因型与等位基因分布情况对比进行χ2检验；通过显性模型、隐性模型、共显性模型拟合进行rs222747、rs222748、rs8065080位点的基因型分析，以多因素logistic逐步回归模型进行相关基因型或等位基因筛选，以是否发生哮喘为因变量，各基因型为自变量，计算各基因型的危险度及95%CI；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRPV1基因型 在哮喘组、对照组中，rs222747、rs222748、rs8065080位点均可检出3种基因型，即rs222747基因型包括CC、GC、GG，rs222748基因型包括CC、TC、TT，rs8065080基因型包括CC、TC、TT。见图1。

2.2 两组研究对象TRPV1基因多态性分布 哮喘组TRPV1基因rs222747位点的3种基因型及等位基因分布与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；而与对照组比较，哮喘组rs222748位点基因型CC携带频率偏低，TC、TT携带频率偏高；rs8065080位点基因型CC携带频率偏低，TT携带频率偏高；rs222748位点、rs8065080位点的3种基因型及等位基因分布差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1～3。

图1 各位点酶切电泳结果

表1 两组研究对象TRPV1基因rs222747位点多态性分布[例(%)]

表2 两组研究对象TRPV1基因rs222748位点多态性分布[例(%)]

表3 两组研究对象TRPV1基因rs8065080位点多态性分布[例(%)]

2.3 小儿哮喘基因型危险度分析 在显性模型、隐性模型、共显性模型中均未发现rs222747位点与小儿哮喘有关联(P>0.05)。在显性模型、隐性模型中均未发现rs222748位点与小儿哮喘有关联(P>0.05)，在共显性模型下，rs222748位点携带基因型TT的小儿患哮喘的风险是携带基因型CC小儿的5.926倍(P<0.05)。在显性模型下，rs8065080位点携带基因型TC+TT的小儿患哮喘的风险是携带基因型CC小儿的5.233倍(P<0.05)；共显性模型下，rs8065080位点携带基因型TT的小儿患哮喘的风险是携带基因型CC小儿的7.058倍(P<0.05)。见表4～6。

表4 TRPV1基因rs222747位点多态性分析(例)

表5 TRPV1基因rs222748位点多态性分析(例)

表6 TRPV1基因rs8065080位点多态性分析(例)

3 讨论

小儿哮喘遗传因素为重要致病内因，环境因素则是主要外因[6-7]。TRPV1作为瞬态电压感受器族的一员，也是一种伤害性刺激整合器，能够被机械刺激、热刺激、活性氧及细胞内外多种刺激因子等直接或间接激活，并促使细胞钙离子内流，从而促进病理状态下呼吸系统的功能调节[8-9]。王强等[10]报道，TRPV1基因3’-UTR多态性是影响中国北京儿童哮喘的重要遗传因素，并证实室内挥发性有机污染物浓度与TRPV1基因多态性对儿童哮喘易感性影响具有协同作用。Veronesi等[11]在研究中发现，辣椒素颗粒吸入物及多种内源性炎性物质能够共同作用于呼吸上皮细胞的TRPV1通道，并促使白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子等炎性介质大量释放，并激活分布于呼吸道黏膜的神经TRPV1通道，最终导致喘息、咳嗽。Rehman等[12]的实验发现，白细胞介素13不仅可使哮喘小鼠肺组织TRPV1表达升高，还能促使支气管上皮细胞TRPV1表达增加，认为TRPV1基因与哮喘小鼠气道高反应性、炎症反应及上皮下纤维化有关。Chen等[13]通过logistic回归分析证实，TRPV1表达水平、IL-4水平和TRPV1基因rs4790522位点突变是儿童支气管哮喘的主要危险因素。Baker等[14]也认为TRPV1基因突变与儿童哮喘密切相关。

TRPV1基因位于17p13染色体上，其中rs222747位于此基因第9个外显子，其位点常可见C/G突变，rs222748、rs8065080位点C/T突变或变异在蛋白水平上均可表现为异亮氨酸与缬氨酸的转化，此位点的基因多态性与喘息、咳嗽等有关[15-16]。本研究以上述易发生突变的3个位点进行TRPVl基因多态性分析，无论是否有哮喘，rs222747、rs222748、rs8065080位点都可检出3种基因型，其中哮喘组TRPV1基因rs222747位点的3种基因型及等位基因分布与对照组相比未见明显差异，而与对照组比较，哮喘组rs222748位点基因型CC携带频率偏低，TC、TT携带频率偏高；rs8065080位点基因型CC携带频率偏低，TT携带频率偏高；rs222748、rs8065080位点的3种基因型及等位基因分布均有明显差异，初步提示rs222748、rs8065080位点基因突变可能与小儿哮喘相关。进一步进行危险度分析显示，在显性模型、隐性模型、共显性模型中均未发现rs222747位点与小儿哮喘有关联，而在共显性模型下，携带rs222748基因型TT的小儿患哮喘的风险是携带基因型CC小儿的5.926倍；显性模型下，rs8065080位点携带基因型TC+TT的小儿患哮喘的风险是携带基因型CC小儿的5.233倍，共显性模型下，携带rs8065080基因型TT的小儿患哮喘的风险是携带基因型CC小儿的7.058倍，提示TRPV1基因rs222748、rs8065080位点基因多态性可能与小儿哮喘的易感性有关。目前，临床未见TRPV1基因多态性与哮喘相关性的最新报道，关于小儿其他呼吸系统疾病，张小宁等[17]的早期研究显示，TRPV1基因rs222748、rs8065080位点基因多态性与儿童非特异性慢性咳嗽无明显关系；而Turner等[18]则持不同观点，认为TRPV1基因rs222748、rs8065080位点基因多态性与儿童咳嗽有关。导致上述观点差异的原因可能与儿童种族、地区及遗传背景不同有关，TRPV1基因rs222748、rs8065080位点基因多态性对小儿哮喘的影响机制或许与小儿咳嗽类似，但其具体机制仍需深入探讨。

综上所述，TRPV1基因rs222748、rs8065080位点基因多态性可能与小儿哮喘的易感性有关，或可为小儿哮喘的病因研究、临床筛查及干预提供一定参考，但TRPV1基因多态性与小儿哮喘的相关性仍需扩大样本量、多中心的研究以论证。