姜黄素对兔耳增生性瘢痕的抑制作用研究

赵凌昆，陈丽娟，郭云辉，孙琪，吕红梅*

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154002； 2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

增生性瘢痕(HS)是创伤修复的必然产物，严重影响机体的正常功能及美观，给患者心理和身体带来极大的痛苦。由于其确切发病机制尚不明确，故目前临床中无特异性根治方法[1]。外科手术切除、药物治疗、加压及激光治疗等方法是近些年来临床上常用的治疗HS的方法，虽然取得较好的治疗效果，但存在着治疗周期长、复发率高以及副作用大等缺点[2-3]。故从天然药物中筛选更为安全、有效的药物治疗更显尤为迫切。

姜黄素是从我国传统中药——姜黄等的根茎中提取得到的多酚类活性物质，不仅具有消除炎症、抵抗自由基、抑制肿瘤发生发展的作用，还具有抗纤维化的作用[4]，增生性瘢痕即是瘢痕过度纤维化的表现。故本实验以兔耳瘢痕模型为研究对象，探讨姜黄素对增生性瘢痕的治疗效果及作用机制，为姜黄素的进一步开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

姜黄素(美国Sigma公司)；黄凡士林(上海商玺伟康医药用品有限公司)；液体石蜡(国药集团化学试剂有限公司)；复方醋酸地塞米松乳膏(芜湖三益制药有限公司)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；鼠抗人Ki67多克隆隆抗体、兔抗人α-SMA单克隆抗体(英国Abcom公司)；石蜡切片机Leica(德国)；电热恒温干燥箱(沈阳市医疗器械厂)；格兰仕微波炉(顺德格兰仕微波炉电器有限公司)；显微镜(DM 2000)(奥林巴斯株式会社)。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕模型的建立

清洁级新西兰大白兔12只，雌雄不限，体质量2.0～2.7 kg，由辽宁长生生物技术有限公司提供，适应性喂养3 d。根据李荟元等[5]建立的兔耳增生性瘢痕动物模型方法，3 g/100 mL戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉，75%酒精消毒，严格无菌操作，在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管，做6个直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面，每个创面间隔1 cm以上，创面深达软骨层，完整去除软骨膜，压迫止血后创面暴露，自行愈合。

1.2.2 实验分组及给药

瘢痕完全上皮化后将动物随机分为3组，瘢痕模型组(B组)不予特殊处理，姜黄素组(C组)涂抹质量分数为10%姜黄素软膏(通过预实验筛选确定，姜黄素∶凡士林∶液体石蜡=1∶7∶2)，地塞米松阳性药对照组(D组)涂抹地塞米松软膏。每次用量0.1 g，每日2次，连续用药28 d。另留取3只为正常皮肤对照组(A组)。实验结束后将白兔处死，每组各获得标本36个。

1.2.3 HE染色观察

各组标本用4%甲醛溶液固定，酒精、二甲苯脱水、石蜡包埋，4 μm厚度切片, 按照苏木素-伊红(HE)染色操作步骤进行。显微镜下观察各组标本的病理学改变；低倍镜下测量疤痕增生指数(HI)[6]。高倍镜下计算各组瘢痕中单位面积的成纤维细胞数目(NA)。

HI=瘢痕最高点到软骨的垂直距离/正常皮肤到软骨的距离

1.2.4 免疫组化染色观察

石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，甲醇-过氧化氢液封闭，消除内源性过氧化物酶活性，根据抗体要求，按照免疫组化操作步骤进行(SP法)，滴加抗Ki67多克隆抗体及抗α-SMA单克隆抗体，DAB显色，出现棕黄色阳性细胞时，终止反应，封片固定。高倍镜(×400)下随机选取5个部位，采用半定量记分法，根据阳性细胞的染色强度及阳性细胞百分率进行综合评分。0分为无色或无细胞染色；1分为浅黄色或阳性细胞≤25%；2分为棕黄色或阳性细胞26%～50%；3分为棕褐色或阳性细胞>50%；二者相加后0～2分为阴性，3～6分为阳性。

1.2.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

模型组中瘢痕明显高出周围正常组织，厚度约为正常皮肤的2.5倍，质地较硬，淡红色；姜黄素组及地塞米松组中瘢痕体积均减小，质地变软，淡粉色，基本接近正常肤色；各组瘢痕均未超出原创伤范围。

2.2 组织学观察

正常组织中成纤维细胞数目少，密度低，胶原纤维排列整齐。模型组中可见真皮层增厚，大量成纤维细胞及胶原纤维堆积，胶原纤维排列紊乱并伴有炎细胞浸润；姜黄素组及地塞米松组成纤维细胞及炎细胞明显减少，胶原纤维排列相对规则。见图1。

图1 HE染色结果(×200)

2.3 瘢痕增生指数HI

HI被认为是评估瘢痕形成的最客观标准，瘢痕增生过程中细胞的增殖，细胞外基质的沉积，上皮的增厚，都可以通过它来进行量化描述[6]。模型组中HI显著高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；姜黄素组及地塞米松组中HI均较模型组降低，与模型组差异有统计学意义(P<0.05)，但二组之间差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。各组的瘢痕增生指数见表1。

2.4 成纤维细胞密度NA

模型组中NA显著高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；药物治疗组中(姜黄素组及地塞米松组)NA均较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但二组之间差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。各组的成纤维细胞密度见表1。

表1 各组兔耳瘢痕增生指数、成纤维细胞密度的比较

2.5 免疫组织化学染色结果

免疫组织化学结果显示：Ki-67及α-SMA阳性表达分别位于胞核及胞浆内，呈黄色或棕黄色，正常组织中表达极少，模型组织中可见较多的阳性表达，二组差异有统计学意义(P<0.05)；在药物治疗组中，Ki-67及α-SMA表达量均较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，但二组之间差异不明显。具体结果见表2。

表2 各组兔耳Ki67、α-SMA阳性表达水平变化[n(%)]

3 讨论

HS是纤维结缔组织过度增生性疾病，迄今为止，尚无理想药物治疗。我国传统中药在治疗瘢痕方面有着悠久历史，如积雪草苷、苦参碱、丹参酮ⅡA、血竭素B、地龙等均在治疗瘢痕方面取得良好效果[7]。姜黄是我国常见的一种中药，《新修本草》中记载姜黄具有活血行气、通经止痛的功效，归肝、脾经。临床广泛应用于血瘀气滞诸痛，痹证[8]。姜黄素是姜黄中提取的主要活性成分，现代医学研究表明姜黄素不仅具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调脂、抗组织损伤等作用，在预防及治疗肝脏，肺脏等器官纤维化疾病中亦具有明显的效果[4]，因此姜黄素在对抗纤维化疾病中具有潜在的应用前景，有望成为治疗HS的一线用药。

在本实验中，成功建立了兔耳瘢痕模型，每组获得36个瘢痕创面，具有统计学意义。实验结果表明：姜黄素对兔耳瘢痕有明显抑制作用，在药物治疗组中(姜黄素组及地塞米松组)瘢痕体积均减小，质地变软，颜色变浅，具有向正常皮肤转化的趋势，组织学上也证实了这一结论，药物治疗后HE切片显示瘢痕中Fb及炎细胞减少，胶原纤维排列相对规则，同时HI及NA这些量化指标检测结果也提供了强有利的证据，姜黄素组中HI及NA均较模型组小，差异有统计学意义(P<0.05)。

HS作为病理性瘢痕的一种，Fb的异常增殖及向MFb转化是HS发生、发展的关键因素之一[9]。研究表明，在创伤发生后6 d左右Fb在TGF-β1的诱导作用下向MFb转化。MFb不仅高表达α-SMA，还具有强大的合成和分泌胶原蛋白为主要成分的细胞外基质的功能[10]。因此通过α-SMA蛋白的检测可以反映组织中MFb的数量。本实验结果显示：α-SMA在正常组织中极少表达5(13.89%)，模型组中大量表达22(61.11%)，二者具有统计学意义；经姜黄素治疗后，α-SMA蛋白由模型组的22(61.11%)降至13(36.11%)，具有明显差异，提示姜黄素可以抑制HS中Fb向MFb转化，减少α-SMA的表达。

Ki67是1983年由 Gerdes 等发现的一种增殖细胞核抗原，是检测细胞增殖活性最可靠的指标[11]。研究结果显示Ki67在正常组织中阳性表达极少3(8.33%)，模型组中可见大量阳性表达25(69.44%)，而姜黄素组及地塞米松组中Ki67表达量分别为8(22.22%)及10(27.78%)，药物治疗组与模型组有明显差异(P<0.05)，说明模型组中Fb的大量存在与Fb增殖活跃有关，而姜黄素可以抑制Fb的异常增殖。

目前糖皮质激素类药物是治疗HS的首选药物，但是其副作用大，复发率高，不适合长期应用，具有局限性[12]。而姜黄素具有药源丰富、价格低廉、药效安全稳定等优点，故深入开展对姜黄素的研究具有重要的理论及现实意义。