均细化处理对苹果细胞壁多糖结构特性的影响

曹 风 刘 璇 毕金峰* 张 彪 吴昕烨 李 潇

（1 大连工业大学食品学院 辽宁大连116034 2 中国农业科学院农产品加工研究所 农业农村部农产品加工重点实验室 北京100193）

我国是苹果生产及消费大国。苹果除用作鲜食外，主要加工成苹果汁销售[1]。苹果汁是全球贸易量较大的水果加工品，约占全球果蔬汁贸易总量的17%，仅次于橙汁，居世界第二位[2]。果汁按照加工方式不同可分为浓缩还原汁和非浓缩还原汁[3]。鲜榨苹果浊汁，即苹果非浓缩还原汁，未经过繁多的加工程序，其口感新鲜，风味天然，营养丰富，品质更接近新鲜苹果，受到众多消费者的青睐[4]。

鲜榨苹果浊汁虽营养丰富，但稳定性较差，短时间内便会出现混浊、絮状物，甚至出现分层等现象，导致产品品质显著降低。目前，为提高鲜榨苹果浊汁的稳定性，通常采用高压均质（High pressure homogenization，HPH）技术处理果汁[5-6]。根据均质压力不同，将小于200 MPa 的称为HPH[7]。HPH 是利用高压促使苹果汁快速冲进狭窄的缝隙，在此操作过程中苹果汁会受到很强的剪切力、撞击力及孔洞爆发力等作用，苹果汁中的细胞进一步破碎，果胶、纤维素、半纤维素等细胞壁多糖继而释放出来且均匀分散在果汁中，同时蛋白质大分子被破坏，悬浮颗粒的粒径减小，悬浮颗粒间相互作用增强[8-10]。HPH 能钝化果胶甲酯酶活性，以保持果蔬汁的稳定性[11-12]。

HPH 处理果汁虽然会显著提高果汁的稳定性，但其会破坏果汁中营养物质细胞壁多糖的形态[13]，进而影响果汁的品质。果汁中的细胞壁多糖（Alcohol-insoluble residue，AIR）是一类通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，其主要包括果胶、半纤维素、纤维素等多糖大分子。果胶大分子的主链是由多个半乳糖醛酸残基通过糖苷键连接而成，其侧链包含不同单糖，有半乳糖（Galactose，Gal）、岩藻糖（Fucose，Fuc）、鼠李糖（Rhamnose，Rha）等；半纤维素是由多种类型的单糖构成的异质多聚体，这些单糖是木糖（Xylose，Xyl）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、甘露糖（Mannose，Man）以及少量岩藻糖等；纤维素是葡萄糖（Glucose，Glc）以糖苷键连接组成的大分子多糖。AIR 的结构会因样品的来源和加工工艺等条件不同而不同，而有关均细化处理果汁后AIR 结构特性变化的报道较少。

本研究以来自陕西咸阳市的澳洲青苹为原料制备鲜榨苹果浊汁，采用湿法超细精磨和HPH（改变压力、温度及次数）处理苹果浊汁，提取果汁中的AIR，以乳糖醛酸含量、甲酯化度、分子质量、中性糖、结构官能团为指标，通过方差及显著性分析比较均细化处理对苹果浊汁中AIR 结构特性的影响，旨在为后续生产高品质果汁提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验原料

澳洲青苹苹果，于2016年10月份成熟时采摘自陕西省咸阳市。采后置于4 ℃冷库备用，取外观完整且无机械损伤样品进行试验。

1.2 主要试剂

抗坏血酸、丙酮、浓硫酸、氢氧化钠、四硼酸钠、浓盐酸、乙酸铵、乙酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硝酸钠、醋酸钠，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、95%乙醇，北京北化试剂公司；2，4-戊二酮，比利时Acros Organics 公司；99% 3-苯基苯酚、D-半乳糖醛酸、乙醇氧化酶、三氟乙酸，美国Sigma-Aldrich 公司；溴化钾，美国Pike Technologies Inc 公司，以上试剂除特别说明外均是分析纯级。

1.3 主要仪器与设备

HR1876 飞利浦榨汁机，荷兰皇家Philips 公司；JN-02HC 高压纳米均质机 （含加热/冷却循环系统），广州聚能生物科技有限公司；QDSF9000-2B 湿法超细精磨机，无锡轻大食品装备有限公司；T25 高速分散机、RT 高多点数显型加热磁力搅拌器，德国IKA 公司；DHG-9203 电热恒温鼓风干燥箱、DU-20 电热恒温油浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；VORTEX-5 旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DAWN HELEOS-II 多角度激光光散射/凝胶色谱联用仪，美国Wyatt 公司；TENSOR27 傅里叶红外仪，德国Bruker 公司；ICS-5000+离子色谱仪，美国Dionex 公司；HZQ-FI60恒温振荡培养箱，太仓市实验设备厂；UV-1800 紫外分光光度计，日本Shimadzu 公司；雷磁PHS-3C pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；精度0.1 mg 电子天平，德国Sartorius 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 鲜榨苹果浊汁的制备 取苹果果实，清洗干净，晾干或使用纱布擦干。清理果柄后计重。将确定质量的果实切块榨汁，于鲜榨果汁中添加2‰的抗坏血酸进行护色，而后将果汁加热至90℃并维持30 s，最后经200 目的尼龙布过滤得到鲜榨苹果浊汁。鲜榨苹果浊汁使用不同均细化处理，样品编号及处理条件见表1。

表1 样品编号及处理条件Table 1 Sample coding and processing conditions

1.4.2 AIR 的制备 根据Sila 等[14]的方法稍作修改，于鲜榨苹果浊汁中加入95%乙醇（体积比1∶5），浸泡2 h 后抽滤，滤渣用3 倍体积的95%乙醇于烧杯中再次浸泡，分散机分散1 min 后抽滤获得的滤渣再用3 倍体积的丙酮试剂浸泡10 min，最后真空抽滤得到淡黄色粉末状物质，而后于40℃条件下干燥12 h 获得AIR，称重并保存于干燥器中待用。

1.5 指标测定

1.5.1 AIR 半乳糖醛酸含量的测定 根据Blumenkrantz 等[15]的方法，采用比色法，以半乳糖醛酸（Galacturonic acid，GalA）作为标准物质测定。含量以每克细胞壁多糖中含半乳糖醛酸毫克数表示（mg GalA/g AIR）。

样品水解：称取约10 mg AIR 于50 mL 烧杯中，记录准确质量。将8 mL 的硫酸加在冰水浴条件下的烧杯中，启动磁力搅拌，后逐滴加入蒸馏水2 mL，将水和硫酸搅拌混合5 min。后再逐滴加蒸馏水2 mL，磁力搅拌1 h 后定容至25 mL，每个样品做3 个平行。

标准溶液的配制：配制1 mg/mL 的半乳糖醛酸储备溶液，分别取0，0.4，0.8，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4 mL 的储备液，蒸馏水稀释至10 mL，即半乳糖醛酸的质量浓度分别为0，40，80，120，140，160，180，200，220，240 μg/mL，每个浓度做3个平行。

样品测定：准备25 mL 的玻璃试管，移液枪移取水解后的0.6 mL 样品或不同浓度的0.6 mL 标准溶液至玻璃试管中，冰水浴状态下加入0.0125 mol/L 硫酸-四硼酸钠溶液3.6 mL。振荡混匀，100℃油浴处理5 min，反应结束后迅速采用冰水浴冷却，直到试剂降至室温。再加入3-苯基苯酚溶液60 μL（将0.15 g 3-苯基苯酚溶于100 mL 0.5%氢氧化钠配制而成），振荡混匀，于520 nm 波长下测定样品吸光度。对于空白样，其它步骤一样，将60 μL 3-苯基苯酚溶液替换成60 μL 0.5%氢氧化钠溶液，于520 nm 波长下测定其吸光度。

1.5.2 AIR 甲酯化度的测定 根据Sila 等[14]的方法，采用比色法，以甲醇作为标准物质测定AIR 的甲酯化度（Degree of methoxylation，DM）。

样品水解：准备25 mL 的具塞玻璃试管，电子天平称取20 mg 左右的AIR 于试管中，并准确记录其质量。加入蒸馏水8 mL，超声处理10 min，而后加入2 mol/L 氢氧化钠溶液3.2 mL，试剂于20℃的恒温振荡培养箱中反应1 h，此反应过程中每间隔10 min 振荡1 次，之后加入2 mol/L 浓盐酸溶液3.2 mL，于25 ℃恒温振荡培养箱中再反应15 min，最后用0.0975 mol/L（pH 7.5）的磷酸缓冲溶液将样品定容至25 mL，每个样品做3 个平行。

标准溶液的配制：配制10 mg/mL 的甲醇储备溶液 （取633.38 μL 甲醇，用pH 7.5 的0.0975 mol/L 磷酸缓冲溶液定容至50 mL），分别取0，20，60，90，120，150，180，220，240 μL 的储备液，用0.0975 mol/L（pH 7.5）的磷酸缓冲溶液稀释至100 mL，即甲醇的质量浓度分别为0，2，6，9，12，15，18，22，24 μg/mL，每个浓度做3 个平行。

表5对比腹地货源调整前后各主干航线货物选择转运港的总中转时间差。由表5可知，受到腹地货源条件改善的影响，港口群内开通主干航线的港口数量有所增加，如温州港，因该港开发利用的干、支泊位资源数量相对较少，各主干航线货物选择转运港的总中转时间差增长明显。事实上，与上海港、宁波舟山港相比，港口群内其他港口可利用泊位资源相对充足。

样品测定：准备10 mL 的具塞玻璃试管，移液枪移取水解后的1 mL 样品或不同浓度的1 mL标准溶液至玻璃试管中，后加入乙醇氧化酶试剂1 mL，振荡混匀，25 ℃水浴条件下反应15 min，后再加入戊二酮溶液2 mL（溶液含有0.02 mol/L 2，4 戊二酮、2 mol/L 乙酸铵及0.05 mol/L 乙酸），振荡混匀，再将玻璃试管换至58 ℃水浴条件下反应15 min，冰水浴迅速冷却，振荡混匀，于412 nm 下测定样品吸光度。对于空白样，其它步骤一样，最后将2 mL 戊二酮溶液换成2 mL 蒸馏水，于412 nm 波长下测定吸光度。

1.5.3 AIR 中性糖的测定 根据Šimkovic 等[16]的方法稍作修改。称取约5 mg AIR 于水解管中，记录准确质量。加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，充氮1 min 排氧，于120 ℃烘箱中水解1 h，冷却后氮气吹干，蒸馏水溶解定容至5 mL。样品稀释一定倍数，过0.45 μm 滤膜后进样。测定使用CarboPac PA20 类型的分析柱，选用0.25 mol/L 氢氧化钠及1 mol/L 醋酸钠作为本试验的流动相，设置流速0.5 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测器采用脉冲安培检测器。

1.5.4 AIR 分子质量的测定 根据Njoroge 等[17]的方法稍作修改，测定AIR 的重均分子质量（Weight average molecular weight，Mw） 和数均分子质量 （Number average molecular weight，Mn）。样品选用0.1 mol/L 硝酸钠为溶剂配制质量浓度为1 mg/mL 的溶液，进样前还需过0.45 μm 的滤膜。测定采用SHODEX SB-806M 类型的色谱柱，另设置0.1 mol/L 硝酸钠为流动相，设置流速0.5 mL/min，时间30 min，进样量100 μL，柱温35 ℃。

1.5.5 AIR 红外光谱的测定 根据Park 等[18]的方法稍作修改，采用傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 进行扫描AIR，在105 ℃的烘箱中烘干溴化钾试剂，将1 mg AIR 与100 mg 溴化钾混合、研磨并压成薄片。测定选择4 cm-1的扫描分辨率，共做64 次扫描，并在4 000～400 cm-1区域内扫描。

1.6 数据分析

本试验数据采用SPSS 21.0 软件进行分析，使用Origin 9.0 和Heml 1.0 软件绘制试验分析图，显著性差异水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 均细化处理对AIR 中GalA 含量的影响

均细化处理样品AIR 中GalA 含量变化如图1所示。进料温度为25 ℃的样品和湿法超细精磨的样品中GalA 含量均低于进料温度为50 ℃和70℃的样品，可见GalA 含量对进料温度较敏感。湿法超细精磨处理的样品比进料温度25 ℃处理的大多数样品GalA 含量多，可推测湿法超细精磨能较好地均一化果汁，使细胞壁多糖大分子释放出来，利于人体对膳食纤维的吸收。由进料温度25℃，均质1 次，不同均质压力处理样品的结果可知，随着均质压力的升高，GalA 含量呈先增加后减少的趋势，在均质压力为100 MPa 时，GalA 含量最多。由进料温度25 ℃，均质压力60 MPa，不同均质次数处理样品的结果可知，随着均质次数的增加，GalA 含量有所增加，然而增加不显著。由均质压力60 MPa，均质1 次，不同进料温度处理样品的结果可知，随着进料温度的升高，GalA 含量呈逐渐增加的趋势。这与Manel 等[19]和Zhang 等[20]提出的高温使GalA 含量增加相符。

2.2 均细化处理对AIR 甲酯化度的影响

均细化处理样品AIR 的DM 如图2所示，DM范围为62%～77%。湿法超细精磨处理的样品与HPH 处理的样品DM 有差别，除与进料温度70℃的样品差异显著外，与其它样品差异性均较小。随着均质次数的增加，DM 虽有所升高，但不显著，这可能归因于果汁经再次均质的过程中甲酯键的断裂数量越来越少。随着均质压力和进料温度的不断升高，DM 呈不断升高的趋势，在均质压力150 MPa 时，DM 达最高值70%。DM 随均质压力和进料温度的升高而不断升高的现象，应与果汁中的果胶甲基酯酶有关。果胶甲基酯酶（Pectin methyl-esterase，PME） 作用于果胶的半乳糖醛酸主链，使其脱去甲氧基生成低甲氧基果胶[21]。HPH可钝化果汁中酶的活性，高温更是使酶失去活性，70 ℃条件下的DM 较高，因为此高温下PME 活性较低，PME 对甲酯基的酶解作用较弱。Navarro等[22]研究表明，样品经150 MPa 的HPH 处理后，PME 的活性降低。王淑珍等[23]研究也表明热处理过程中，高温降低了PME 的活性，样品的DM 随之升高。

图1 均细化处理对AIR 中GalA 含量的影响Fig.1 Effect of refining treatments on GalA contents of AIR

图2 均细化处理对AIR 甲酯化度的影响Fig.2 Effect of refining treatments on DM of AIR

2.3 均细化处理对AIR 傅里叶红外光谱的影响

图3 均细化处理对AIR 傅里叶红外光谱的影响Fig.3 Effect of refining treatments on FTIR of AIR

均细化处理样品的AIR 傅里叶红外光谱图如图3所示。FTIR 可有效解析细胞壁的结构和组成变化[24]。3 600～2 500 cm-1范围间的红外光谱宽峰为半乳糖醛酸聚合物分子间与分子内氢键引起的O-H 伸缩振动，表明了AIR 的几种结构特征[25-26]。由图可知，在进料温度70 ℃，均质压力60 MPa，均质1 次时，样品的O-H 键数量最多，这可能是较高的温度使原本缔合的氢键断裂。在3 000～2 750 cm-1范围的吸收峰是指C-H 伸缩振动，包括CH，CH2和CH3拉伸和弯曲振动[27]。在经过不同均细化处理的样品中，都可观察到C-H 吸收峰，然而差异性较小。在1 650 cm-1附近出现的吸收峰，为甲酯化羧基的C=O 不对称伸缩振动；在1 550 cm-1附近的吸收峰为羧酸根离子引起的较强不对称伸缩带；在1 400 cm-1附近的吸收峰为羧酸酯引起的较弱对称伸缩带[28-30]。1 650 cm-1附近的峰面积与在1 650 cm-1和1 550 cm-1附近的峰面积之和的比值为DM[31]，由图可知，所有样品的DM 均大于60%，即各样品为高酯化度果胶。由图中信息可知经进料温度70 ℃，均质压力60 MPa，均质1 次处理的样品在1 650 cm-1处有较强的C=O 伸缩振动，表明此处理方式后的样品分子内部间发生了聚合。在1 250 cm-1左右的吸收峰值是不对称的C-O-C 伸缩振动峰值，即AIR 中有-OCH3存在；吡喃糖环的醚键和羟基的吸收峰值在1 200～1 000 cm-1之间，由图可知，AIR 中存在此结构[32]；在900 cm-1左右的吸收峰值是D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰值，在3 300～3 500 cm-1（-NH2）处没有双峰，表明AIR 中没有蛋白的存在[33]；900～750 cm-1范围的吸收峰表明样品中有α、β-糖苷键及甘露糖的存在。

2.4 均细化处理对AIR 分子质量的影响

图4 均细化处理对AIR 分子质量的影响Fig.4 Effect of refining treatments on molecular weight of AIR

均细化处理样品的AIR 分子质量如图4所示。除进料温度为50 ℃和70 ℃的样品外，湿法超细精磨的样品Mw 最大，可见湿法超细精磨处理对多糖的降解作用较强，这与前文样品经湿法超细精磨后GalA 含量较多一致。随着均质压力的增加，Mw 呈逐渐降低的趋势，样品的均质压力为150 MPa 时，下降最多，这一结果与Villay 等[34]的研究一致，HPH 处理样品可使其多糖解聚，压力较高时，效果更显著。样品经进料温度25 ℃，均质压力60 MPa，不同均质次数后，其Mw 差别不显著。随着进料温度的升高，Mw 呈逐渐增加的趋势，果胶、半纤维素、纤维素等大分子多糖在短时间的高温下可能又发生了聚合。对于多分散系数Mw/Mn，湿法超细精磨处理样品后的Mw/Mn 最小，说明此加工方式后样品中多糖的分子质量分布较集中，其长短链均匀分布。不同均质压力处理后，除30 MPa 外，压力升高，Mw/Mn 逐渐减小，由此可知，高压使多糖大分子发生降解和溶解，促进多糖大分子的分子质量分布均匀。随着均质次数的增加，Mw/Mn 不断降低，表明均质次数对样品分子质量均匀化有加速作用。结果还表明，50 ℃处理后的样品Mw/Mn 在不同进料温度处理条件下最小，可知分子质量对温度较敏感，分子质量分布均匀化过程中存在温度关键点；Mw 大的样品，其GalA 含量一般较高。例如：经进料温度50 ℃和70 ℃以及湿法超细研磨处理后的样品。

2.5 均细化处理对AIR 中性糖的影响

图5是均细化处理苹果浊汁后，果汁中AIR的7 种单糖含量热图，最后一列是7 种类型单糖含量总和。热图可以较直观清晰地显示不同均细化处理样品后AIR 中各类型单糖含量的差异。图中均细化处理样品中的不同类型的单糖含量以深浅不同的颜色表示。某一类单糖的含量越多，则其红色越深，某一类单糖的含量越少，则其蓝色越深。

由图5可知，不同均细化处理样品后的AIR中性糖类型未变，均含有7 种单糖，各类型单糖含量比较，均以Glc 含量最多，其次是Gal 含量，Fuc以微量形式存在。AIR 的主要成分为半纤维素、纤维素，均含有Glc，而且纤维素是主要由Glc 组成的大分子多糖，这可能是AIR 中Glc 含量最多的原因。在所有的均细化处理条件中，进料温度25℃，均质压力60 MPa，均质2 次处理的样品中有5种单糖含量较多，可见样品经此加工条件后，线性、非分支多糖大分子被破碎成较多的小片段。不同均质压力处理样品，30 MPa 和150 MPa 处理后获得的中性糖含量差异性较小。湿法超细精磨与HPH 处理的大部分样品中性糖含量差异性不大，可见湿法超细精磨对细胞壁多糖大分子的破碎能力与HPH 差不多。不同均质次数均细化处理样品后，均质1 次和3 次的中性糖含量差异性较小。不同进料温度处理样品后，在进料温度25 ℃下的各类型单糖含量较多，进料温度升至50 ℃和70 ℃时，各类型单糖含量减少，这与前文Mw 部分猜测的多糖大分子在高温下可能又聚合一致。

由图5可知，不同均细化处理样品后的中性糖总量也有一定差别，各类型单糖在一些酶的催化下可互相转化，单糖同分异构体间也可在一定条件下互相转化，在加工过程中，存在很多环节，因此单糖互相转化是一个复杂的过程，有待进一步深入研究。

AIR 中主要大分子物质为果胶，AIR 中性糖含量组成也在一定程度上反映果胶的结构域。Rha含量较少代表着果汁中果胶的RG-I 型结构较少，其主要以HG 和RG-II 型为主。中性糖含量偏高者大多为Mw 小的样品，例如均质压力150 MPa处理样品后的Mw 最小，其中性糖总量最多。这些中性糖主要来源于AIR 中多糖大分子的侧链区域，在高压条件下，侧链区域被破碎成小分子的片段，此研究结果与前面Mw 部分，高压使样品多糖解聚一致。

图5 均细化处理苹果汁中AIR 的中性糖组成热图Fig.5 Neutral sugar compositions heatmap of AIR in refining treatments apple juice

3 结论

澳洲青苹的鲜榨苹果浊汁经湿法超细精磨和HPH 处理后，其AIR 结构特性呈不同特点。

随着均质次数的增加及进料温度的升高，GalA 含量呈逐渐增多的趋势。在所有均细化处理样品中，经进料温度70 ℃处理的样品GalA 含量最多，由此可知，GalA 含量对温度较敏感。DM 随均质压力、均质次数及进料温度的增加而不断升高。均细化处理样品的DM 均大于60%，即各样品为高酯果胶。Mw 随均质压力增加不断减小；Mw/Mn除30 MPa 外与Mw 趋势一样；Mw/Mn 随均质次数的增加不断降低；Mw 随进料温度的升高不断增加。均细化处理样品中均含有7 种类型单糖，各类型单糖含量中Glc 含量最多，其次是GalA 含量，Fuc 以微量形式存在。

AIR 包含的果胶、半纤维素及纤维素等多糖大分子是果汁中的主要营养物质，均细化处理后，营养物质的状态会受到一定程度的改变，进而影响果汁的营养价值。前人研究已表明高压均质可提高果汁稳定性，后续可详细探究加工过程中果汁稳定性与果汁中营养物质AIR 的关联特性。