电针对胰岛素抵抗大鼠氧化应激状态及线粒体形态结构的影响*

张婧怡，李 瑞△，曹昺焱，宋姗姗，金永祚，金奉奎，段浩茹

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)又称为非胰岛素依赖性糖尿病，临床以慢性高血糖为主要症状，常合并多个代谢综合征，如高血压、高血脂，对人体危害性极大。根据2017年中国2型糖尿病防治指南[1]，我国患病率高达10.4%。现代医学主要以降糖药物如二甲双胍、α-糖苷酶抑制剂或胰岛素注射等手段对患者血糖进行控制，易有诸多不良反应或药物耐受等情况，且医疗支出高昂，对国家或地区经济发展不利。针灸疗法已被证实可有效降低T2DM患者血糖[2]，且具有高效、价廉和副作用小等优点，临床应用价值极高。

胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)是T2DM的主要致病因素及病理生理学特征[3]，直接引起胰岛素调控葡萄糖代谢能力下降。氧化应激(Oxidativestress,OS)可通过激活蛋白激酶C[4]、cJun氨基末端激酶通路[5]和核转录因子[6]等多途径，干扰胰岛素信号通路，并且破坏线粒体形态功能，是引起IR的重要因素之一。本研究将选取优势经验穴组，通过对T2DM大鼠血糖、自由基和抗氧化因子水平分析，结合电镜观察骨骼肌线粒体结构，研究电针对2型糖尿病大鼠氧化应激、线粒体形态结构及胰岛素抵抗状态的影响，探讨电针治疗2型糖尿病的治疗机制。

1 实验方法

1.1 实验动物

选取7只2月龄体质量为140～160 g的SPF级雄性非糖尿病大鼠(Zucker lean,ZL)(fa/+)及14只2月龄同体质量的SPF级雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat,ZDF) (fa/fa)。两种大鼠皆购自北京维通利华公司[许可证号SCXK(京)2016-0006]。实验大鼠均于室温23°C，空气流通良好，相对湿度50%～60%，且12 h昼夜循环光照环境下进行饲养。适应性饲养4周，期间全部大鼠自由饮食水。

1.2 实验材料及仪器

ACCU-CHEK血糖仪(德国罗氏公司，LOT 10129770);罗氏血糖试纸(LOT 24685431);Purina #5008饲料(粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纤维≤4.0%，高糖高脂饲料);中研太和牌针灸针0.13 mm×7 mm(212161123，北京中研太和医疗器械有限公司);采血针(华鸿牌);电针仪(英迪牌电针仪);自制鼠套等。

1.3 模型建立与分组

适应性饲养后，全部大鼠均改为Purina #5008饲料持续喂养。4周诱导饲养后，取大鼠尾尖静脉血，测其空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)及口服葡萄糖耐量试验2 h血糖(OGTT2h)，以二者血糖均>11.1 mmol/L为造模成功标准。根据FBG水平将成模的ZDF大鼠随机区组，分为模型组、电针组两组。7只ZL大鼠为空白组。

1.4 干预方法

1.4.1 空白组及模型组 不干预。

1.4.2 电针组 将大鼠固定于自制棉鼠套静置5 min，针刺双侧“后三里”“三阴交”“脾俞”“胃脘下俞”，并连通电针仪，电针一端连接于“后三里”，一端连接同侧“胃脘下俞”，以连续波、频率15 Hz、电流输出强度2 mA刺激穴位，留针20 min，每日1次，共4周，第7、14、21、28天不进行干预。

以上各种干预操作均于每日13:00—18:00期间进行，连续干预4周。于干预第6、13、20、27天晚20:00禁食，次日早8:00检测空腹体重、血糖。

1.5 指标检测

所有动物全部干预结束后，自由饮食水，于实验结束当晚22:00禁食，次日早8:00以2%戊巴比妥钠溶液按照45 mg/kg的药量比腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5～10 mL离心管中，室温静置凝固后，于4℃条件下3 000 r/min离心15 min分离血清，运用全自动生化分析仪检测：总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量。

1.6 胰岛素抵抗指数

根据胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)计算公式：HOMA-IR=(空腹血糖×空腹胰岛素)/22.5，计算各组大鼠全部干预结束后胰岛素抵抗指数。

1.7 统计分析

2 实验结果

2.1 各组大鼠FBG比较

由表1可知，造模前后，模型组与电针组大鼠FBG差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。造模后模型组与电针组较空白组FBG明显升高(P<0.05)，提示造模成功。全部干预结束后，模型组与电针组较空白组FBG值仍有升高(P<0.05)；模型组较电针组FBG值差异无统计学意义(P>0.05)，但全部干预后电针组FBG较干预前FBG有所降低(P<0.01)，差异具有统计学意义，而全部干预结束后模型组FBG较干预前FBG差异无统计学意义(P>0.05)，显示电针组具有一定降糖效果。

表1 各组大鼠造模前后与全部干预后FBG比较

2.2 各组大鼠全部干预后HOMA-IR比较

由表2可知,与空白组比较，模型组、电针组HOMA-IR值明显升高(P<0.01)，模型组与电针组差异无统计学意义(P>0.05)，结合MS比较，电针组HOMA-IR略低于模型组。

表2 各组大鼠全部干预后HOMA-IR比较

2.3 各组大鼠血清T-AOC、ROS、MDA和SOD水平比较

由表3可知，模型组、电针组与空白组相比，T-AOC、SOD降低(P<0.05)，ROS、MDA均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，电针组ROS、MDA有所减少(P<0.05)，T-AOC较之增加(P<0.05)。而二者间SOD差异无统计学意义(P>0.05)，但结合MS分析，电针组SOD略高于模型组。

2.4 各组大鼠股四头肌线粒体电镜观察

通过电镜观察可知，空白组大鼠股四头肌线粒体多呈长椭圆形，线粒体嵴清晰，结构完整，排列紧密；模型组线粒体出现不同程度结构缺失，线粒体嵴模糊，结构松散，排列稀疏松散，甚至部分呈空泡状；电针组较模型组有所改善，大部分线粒体结构正常，有部分嵴模糊，但基本具有完整结构。见图1。

表3 各组大鼠血清T-AOC、ROS、MDA和SOD水平比较

图1 电镜下各组大鼠股四头肌线粒体(120 000×)

3 讨论

氧化应激是指机体遭受有害刺激后，体内活性氧(ROS)等自由基产生过多导致组织损伤[7]，而ROS主要来源之一就是线粒体。线粒体是机体最重要的能量供应中心，提供了生命活动所需的90%三磷酸腺苷(ATP)。在合成ATP过程中，部分氧分子被还原成ROS。正常状态下，机体内具有完善的抗氧化系统，自由基与抗氧化因子保持着动态平衡，如超氧化物歧化酶(SOD)，可与O2-发生反应，将对机体有害的自由基转化为无害的H2O和O2，有效控制体内自由基水平[8]。而病理状态下，ROS过量产生，其水平超出氧化物清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，可引起生物膜结构及其功能被破坏，最终降解为丙二醛(MDA)[9]。另一方面，由于线粒体结构独特，其DNA几乎全部由编码区构成，没有保护蛋白，也是ROS主要攻击对象。OS状态下，ROS可直接干扰线粒体DNA、RNA复制，破坏线粒体形态结构，引起线粒体功能障碍[10]。而线粒体结构被破坏，又会增加ROS产生，形成恶性循环。由于ATP是人体能直接利用的唯一能源，且90%以上由线粒体的氧化磷酸化过程产生。线粒体结构、功能损伤会导致其对葡萄糖的氧化分解减少、ATP生成减少，机体能量供应不足，在宏观上表现为胰岛素抵抗和高血糖状态[11]。

临床上，针灸已被广泛应用于治疗2型糖尿病患者[12]，且对胰岛素抵抗状态有明显改善作用。李海燕等[13]通过实验，验证了针灸可降低人体胆固醇、甘油三酯和HOMA-IR等指标。在治疗氧化应激方面，也有多个研究表明[14-16]，针灸具有良好抗氧化作用，可以有效降低机体MDA水平，提高SOD活性及其水平，调节机体内氧化与抗氧化因子的平衡，缓解氧化应激。同时，针灸也可保护机体线粒体，高明等[17]发现针刺对线粒体结构形态、数量有明显的正向影响。李强等[18]对IR状态下的大鼠进行针刺干预，结果显示针刺组较模型组ATP生成量增加，说明针灸提高了线粒体合成ATP能力，保护了线粒体正常形态及功能。

《灵枢·本脏》曰：“脾脆则善病消瘅易伤”，说明消渴与中焦脾胃关系极为密切，脾胃失常可多方面影响机体，最终发为消渴。脾为后天之本，负责运化水谷，输布水谷精微，且脾主肌肉，这与现代研究中骨骼肌承担80%葡萄糖的摄取及代谢不谋而合[19]。同时，脾虚者因其运化水谷能力减弱，四肢百骸不得滋养而易乏力，也与2型糖尿病患者常见乏力症状相符。在IR状态下，线粒体形态结构被破坏，葡萄糖进入细胞后代谢过程出现障碍，机体ATP生成减少，生命活动所需能量减少，易产生乏力、倦怠。因此，本研究中选取了足三里、脾俞、胃脘下俞3穴进行针灸刺激。足三里、脾俞，一为胃经要穴，一为背俞穴，可直接调理脾胃，改善机体水谷运化，调节气机；《难经》记载:“脾重二斤三两，扁广三寸，长五寸，有散膏半斤”，结合现代解剖学分析，中医之脾也包括胰腺，即“散膏”也，因此选取胃脘下俞调节脾胃功能，且胃脘下俞也为治疗消渴经验用穴；三阴交为肝、脾、肾三阴经交会穴，肝藏血，脾统血，肾藏精，精血相生，对与血相关的疾病有明显治疗作用。

本研究中，经电针刺激后三里、脾俞、胃脘下俞、三阴交4穴后，电针组大鼠较模型组：T-AOC升高(P<0.05)，抗氧化因子SOD含量也有所提高，反之ROS、MDA降低(P<0.05)，说明电针可缓解机体氧化应激状态。从电镜观察可知，电针组大部分线粒体嵴清晰，细胞器膜完整，分布紧密，说明氧化应激得到缓解后，骨骼肌线粒体形态结构受损程度减轻。与此同时，这也使得线粒体途径产生ROS减少，形成良性循环。通过分析比较两组HOMA-IR可知，电针组胰岛素抵抗状态较模型组有所改善，证实了氧化应激与胰岛素抵抗存在关联性，且电针可减缓IR。比较两组血糖，可发现电针组血糖得到良好控制(P<0.05)，明显优于模型组，电针具有显著改善2型糖尿病大鼠血糖作用。

综上所述，电针可通过调控氧化-抗氧化系统平衡，缓解氧化应激状态，由此保护线粒体免受氧化应激损伤，维护线粒体正常形态结构，减少其功能障碍、数量减少，增加2型糖尿病大鼠葡萄糖代谢能力，以此改善胰岛素抵抗、降低血糖。