电针内关穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中M2AChR、α7nAChR的影响*

石 力，周振坤，苗瑞恒，姜 敏

(首都医科大学附属北京世纪坛医院,北京 100038)

冠心病是世界范围内首要致死原因，目前PCI术是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的重要方法。对于ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死及不稳定心绞痛，血运重建能够有效地降低心血管病不良事件[1-2]。但是，在血运重建治疗后仍然存在很多问题需要解决，在心肌缺血的基础上重新恢复血流后，不仅不能改善心脏功能，反而加重心肌结构和心脏功能的损伤，甚至是不可逆的损伤。这种心肌缺血再灌注损伤将导致致命性的心率失常、心力衰竭。在接受PCI术后的25%患者中会出现血清心肌酶的增高，包括cTnI[3-4]。大量的证据证明心肌酶的释放增加与PCI术后的心肌损伤和延迟死亡率密切相关[5-6]。对于稳定性心绞痛，尽管PCI能够更大程度地缓解心绞痛，但其预后一直饱受争议，认为PCI与药物治疗相比，并没有降低死亡率及心血管死亡、非致死性心肌梗死或血运重建的风险[7]。大约1/3的选择性PCI术后将伴随着心肌损伤及随后将发生的心血管事件(包括心律失常、心功能异常)，甚至死亡[8]。

中医药治疗对PCI术后心肌损伤有一定疗效。针刺治疗是一种安全无副作用且价格低廉的治疗方式，寻找针刺治疗PCI术后心肌损伤的治疗方案，具有重要的临床价值；尤其对于择期PCI围手术期心肌损伤的患者，如果能够有效的降低其死亡率及不良心血管事件的发生率，将具有重大的临床意义和社会价值。临床研究及基础研究均表明内关穴对缺血心肌有特异性的保护效应[9-12]，是治疗心肌缺血性疾病常用的腧穴，不同刺激强度和频率可能产生不同的针刺效应[13-15]，本研究探讨不同电针频率对心肌缺血再灌注损伤的保护效应。另外，其作用机制十分复杂，目前仍不十分清晰。有研究提示M2AChR参与介导了电针内关穴对力竭游泳诱导心肌缺血的保护效应[16]，M2AChR和α7nAChR是副交感神经递质乙酰胆碱在心脏的主要作用靶点，本研究观察不同频率电针对M2AChR和α7nAChR表达的影响，对其作用机制进行初入探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及设计

清洁级健康成年雄性SD大鼠(6～8周，体质量200～250 g)32只，均由中国食品药品检定研究院提供，生产许可证号：SCXK(京)2014-0013。动物进入实验室后适应性喂养7 d，饲养条件温度(25±3)℃、湿度50%～60%，可以自由取食并保持昼夜节律。将大鼠随机分为假手术组、模型组、低频电针组和高频电针组，每组各8只。所有的实验操作均经首都医科大学北京世纪坛医院伦理委员会批准。

假手术组行开胸手术仅穿线不进行结扎，模型组结扎冠状动脉前降支并行再灌注处理，低频电针组在模型组的基础上于术前7 d施以低频电针刺激，高频电针组在模型组的基础上于术前7 d施以高频电针刺激。手术过程中记录各组大鼠心电图的变化。手术后取各组大鼠的血液，检测血清中心肌损伤标志物，取左心室心肌组织进行蛋白质印迹法(Western Blot)检测心肌组织中M2AChR、α7nAChR的表达。

1.2 造模方法

大鼠术前称重，并禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg,Sigma Aldrich；Merck KGaA,Darmstadt,Germany)对大鼠进行麻醉，采用仰卧位进行固定，用小动物呼吸机辅助通气(潮气量为5 mL/100 g，频率60～80次/min，采用呼气末持续正压通气)，通过胸骨左侧第3、4肋间切开，暴露心脏。假手术组仅对大鼠于左心耳下缘2 mm处进行左前降支分离穿线；其他各组在距左心耳下缘2 mm处将4-0号丝线穿过左前降支并在左冠状静脉上放置一个自制塑料套管结扎30 min，然后取下塑料套管，再灌注2 h，诱导缺血再灌注损伤。用RM6240B多道电生理仪(成都仪器厂)记录大鼠Ⅱ导心电图。

1.3 针刺方法

在2%异氟烷的吸入麻醉下行电针刺激。内关穴位于大鼠前肢掌侧腕关节上1.5 cm处，在尺骨与桡骨之间。将一次性无菌不锈钢针灸针(0.25 mm×13 mm，华佗牌)迅速垂直刺入双侧内关穴约2 mm，并连接穴位神经电刺激仪(韩氏-200A，南京济生医疗科技有限公司)。低频电针组每日予强度为1 mA、频率为2 Hz的电针刺激，高频电针组每日予强度为1 mA、频率为50 Hz的电针刺激，每日30 min，于术前7日每日进行电针刺激。

1.4 心肌酶测定

术后由右房取血4 mL，离心后取血清，以日本日立7160全自动生化仪检测大鼠血清中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平。

1.5 蛋白质印迹法(免疫印迹实验，Western Blot)

将心肌组织称重，并以1∶9的比例与裂解缓冲液混合。加入含1 mM PMSF的RIPA缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，用高速组织匀浆器(IKAT10，IKA，德国)在冰上以15 000 rpm匀浆组织，然后在冰上孵育20 min。将所有组织样品在14 000 rpm、4℃下离心20 min，并收集上清液。样品中蛋白质的浓度采用BCA蛋白质定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)进行测定。向样品中加入5×SDS上样缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)将浓度调节至2 μg/μL。将样品在100℃加热5～10 min使蛋白质变性。

制备10%分离胶和5%浓缩胶，并将10 μL样品添加到每个孔中。电泳条件为：浓缩胶电泳的电压为90 V，20 min；分离胶电泳条件为160 V，根据预先染色的蛋白质标记物来确定停止电泳的时间。采用湿转法将蛋白质转移到PVDF膜上。然后将膜封闭45 min，并分别与抗α7nAChR抗体(ab10096，abcam)、抗M2AChR抗体(ab109226，abcam)、GAPDH抗体(稀释比例)在冰箱中孵育过夜。然后将膜与山羊抗兔IgG(H+L)HRP[Abcam Trading(Shanghai)Company Ltd.]在室温下孵育1 h，用TBST洗涤4次。采用曝光显影，用Image J软件(美国国立卫生研究院)测量条带的灰度值。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 心电图及ST段幅值变化

大鼠冠状动脉LAD结扎30 min后，ST段显著抬高(P<0.01)，QRS波群与T波融合。低频电针预处理后，观察到结扎30min时ST段抬高的幅度较模型组明显降低(P<0.01)；而高频电针预处理后，ST段抬高的幅值与模型组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验观察到再灌注后，ST段逐渐回落。再灌注2 h时，部分大鼠出现ST段压低，各组大鼠ST段幅值差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

图1 各组大鼠标准Ⅱ导心电图

表1 各组大鼠标准Ⅱ导心电图ST段幅值

2.2 血清心肌酶水平

模型组大鼠心肌酶CK-MB、LDH较假手术组显著升高(P<0.01)。经低频电针预处理后，大鼠心肌酶CK-MB、LDH均较模型组降低，且差异有统计学意义(P<0.05)。而高频电针组大鼠的血清CK-MB、LDH较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清CK-MB、LDH水平

2.3 心肌组织中M2AChR、α7nAChR的表达

模型组大鼠左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR相对表达量较假手术组显著降低(P<0.01)。低频电针预处理可使心肌缺血再灌注模型大鼠左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR相对表达量明显升高(M2AChR，P<0.05；α7nAChR，P<0.01)。高频电针预处理对心肌缺血再灌注模型的左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR相对表达量影响差异无统计学意义(P>0.05)。见图2～3、表3。

图2 各组大鼠左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR条带灰度

注：A.M2AChR；B.α7nAChR。与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图3 各组大鼠左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR相对表达量

表3 各组大鼠左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR相对表达量

3 讨论

心包络与心关系密切，有“代心主事”的功能。《医学正传》中述：“心包络，实乃裹心之包膜也，包于心外，故曰包络也”。心包是心主之脉，能够代心受邪。《类证治裁·心痛论治》曰：“心为君主，义不受邪，故心痛多属心包络病”。《圣济总录·小儿心痛》云：“包络者，心之别脉，邪气客之，则厥气上逆，痞而不散，故发为心痛。”“内关穴”早在《灵枢·经脉》篇中就有所记载：“心手主之别，名曰内关……循经以上系于心包，络心系。实则心痛，虚则烦心，取之两筋间也。”内关穴为心包经的络穴，是治疗心肌缺血性疾病的重要腧穴。本研究观察到低频电针内关穴预处理可降低结扎冠状动脉LAD 30 min后心电图ST段的幅值，并可显著降低大鼠血清心肌酶CK-MB、LDH的水平，而高频电针预处理后未观察到此效应。既往有研究提示低频电针内关穴对缺血心肌有保护作用，可以减轻心肌缺血的病理变化[17]，与本研究结果相符合。本研究不仅证实了内关穴对心肌缺血再灌注损伤的保护效应，也提示电针参数是影响针刺效应的重要因素，低频电针内关穴预处理可减轻心肌缺血再灌注损伤。

心脏的自主神经系统由交感神经通路和副交感神经通路组成， 副交感神经通过胆碱能信号通路来调节心脏功能，迷走神经刺激可以减轻心肌缺血再灌注损伤[18]。乙酰胆碱的受体包括毒蕈碱型受体和烟碱型受体，而M2AChR是分布于心肌细胞的主要亚型[19]，α7nAChR分布于心脏神经元、纤维原细胞及心肌细胞[20]。有研究提示针刺内关穴对心交感神经和副交感神经的均衡性有调节作用[21]，可使室性期前收缩模型大鼠迷走神经放电活动减少、交感神经放电增加[22]。本研究提示，低频电针刺激内关穴能够增加心肌缺血再灌注大鼠左心室M2AChR、α7nAChR的表达，可能是通过增加心副交感神经兴奋性来实现的，这一假设需要在未来的实验中通过检测大鼠的心率变异性及副交感神经放电等实验来进一步证实。

M2AChR对心肌缺血再灌注损伤的保护机制有以下几个方面。第一，心肌缺血时可引起交感神经的过度兴奋，儿茶酚胺大量释放，β1AR的表达显著增加[23]，β1AR-Gs-AC-cAMP-PKA通路活性增加，进而引起心肌细胞内钙超载,M2AChR与Gi蛋白相结合，分离出α亚基，以抑制AC-cAMP-PKA下游通路的活性，抑制L型Ca2+通道的激活，抑制Ca2+内流，从而减轻细胞内钙超载；第二，M2AChR激活可增加NO的生成，在一项离体心肌缺血再灌注的实验中，选择性M2AChR受体激动剂可增加NOx的产生，可减轻心肌缺血再灌注损伤[24]，对LVDP有改善作用;第三，M2AChR受体信号转导通路可能通过调节基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)的表达来抑制金属基质蛋白酶-9(MMP-9)的活性[25],MMPs的作用是影响细胞外基质(ECM)的降解和转化，细胞之间的粘附[26],心肌组织中ECM的重构与TIMPs和MMPs表达水平的平衡密切相关，MMPs过度表达，ECM降解减少，最终将导致心肌组织纤维化，影响心脏功能[27];第四，ACh可通过激活M2AChR抑制血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ) 诱导的H9c2细胞凋亡，通过下调AT1受体及抑制ROS诱导的p38 MAPK激活及调节Bcl-2、Bax和caspase-3[28]。

心肌缺血再灌注损伤是一种过度的系统性炎症反应，神经系统参与整合并调节炎症反应，特别是胆碱能通路抑制巨噬细胞和细胞因子释放的机制[29]。α7nAChR对心肌缺血再灌注损伤的保护效应机制主要为抑制炎症反应。α7nAChR激动剂可以抑制缺血再灌注损伤模型大鼠血清中TNF-α和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的水平，抑制系统性炎症反应，减少心肌梗死面积及降低血清TnI的水平[30]。另外，α7nAChR激动剂(GTS-21)可以抑制氧化应激引起的心肌细胞凋亡，GTS-21可保护缺血再灌注后心肌细胞线粒体膜的完整性，降低心肌组织中ROS，抑制 JNK和 p38MAPK蛋白的磷酸化[31]。

本研究观察到低频电针预处理可以上调左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR的表达，而高频电针预处理对左心室心肌组织中M2AChR、α7nAChR的表达无显著影响。低频电针预处理可能通过上调并激活M2AChR和α7nAChR起到抑制心肌缺血再灌注引起的心肌细胞内钙超载、抑制炎症反应和抑制心肌细胞凋亡的作用，但其受体后的信号转导机制尚需进一步深入探讨。

4 结论

低频电针预处理可减轻心肌缺血再灌注损伤，并可上调心肌组织中M2AChR和α7nAChR的表达，提示低频电针预处理的保护效应可能与胆碱能受体M2AChR和α7nAChR的激活密切相关。