女性生殖道外泌体在精子成熟与胚胎发育中的研究进展

桂绍涛，赵 晖，熊 磊，罗 韬，雷 银，吴汶钊

外泌体是由机体活细胞通过内吞-融合-外排等生物学机制产生的纳米级囊泡，通过后期向内出芽形成多囊泡体，再通过多囊泡体与质膜融合释放至细胞外[1]，具有双层脂质膜结构，直径30～150 nm[2-3]，甚至可达200 nm[4]。外泌体首次于1983年由Johnstone在羊的成熟红细胞中发现，其在透射电子显微镜下常表现为杯状或双凹碟状，密度在蔗糖浓度梯度及碘二甲醇浓度梯度中分别为1.10～1.21 g/ml和1.10～1.12 g/ml[5-6]。外泌体表面分子通过囊泡黏附至受体细胞表面的脂质和配体，使整个囊泡内化到受体细胞，外泌体膜与受体细胞的质膜融合，从而促进与其他细胞的相互作用[7]。存在于体液中的外泌体在细胞信息交换中起重要作用，其与受体细胞之间存在3种作用机制[8]：①外泌体与受体细胞融合，并将其内容物传送至细胞质溶胶中[9]；②外泌体的跨膜蛋白可直接与靶细胞的信号受体相互作用[10]；③外泌体被内化到受体细胞并出现下列情况，即部分被吞噬的外泌体可以合并形成内体并经历转胞吞作用将外泌体再次释放至邻近细胞，而部分被吞噬的外泌体形成的内体可成熟为溶酶体并降解[11-12]。本文以女性生殖道外泌体在精子成熟与胚胎发育中的研究进展进行综述。

1 女性生殖道外泌体的分离与鉴定

选择分离和纯化的具体方法应考虑样品来源、体积、纯度、完整性、后续分析所需的外泌体及可用的仪器和处理时间，目前常见的外泌体分离方法有离心法(如超速离心法、差速离心法、密度梯度离心法、蔗糖垫离心法)、超滤法(如凝胶渗透色谱法、尺寸排斥色谱法等[13])、沉淀法和免疫磁珠法等[14]。目前从培养的生殖细胞和女性生殖道体液中分离的外泌体常使用超速离心法进行分离。有学者使用蔗糖垫离心法、超滤法和超速离心法分离外泌体，发现超速离心法可以得到足够的蛋白组合转录组学材料以用于进一步分析，明显优于蔗糖垫离心法及超滤法[15]。外泌体分离纯化后进行鉴定的常见方法为透射电子显微镜检测、纳米粒子示踪分析、免疫印迹法、流式细胞术及高分辨率成像等[13]。在透射电子显微镜下可直接观察外泌体的形态和直径，是目前鉴定外泌体的金标准之一，但其无法准确测量外泌体浓度，不适合快速大量检测外泌体。免疫印迹法可鉴定多数外泌体常见蛋白质，如CD63、CD9、CD81、热休克蛋白等跨膜细胞蛋白[16-17]。

2 女性生殖道外泌体的类型

女性生殖道外泌体根据形成部位和生物机制，主要分为输卵管小体、子宫小体和阴道小体。

2.1输卵管小体 输卵管小体于2013年由Al-Dossary等[18]在小鼠输卵管液中首次发现。有文献报道，输卵管小体是输卵管液的主要成分，并且是与配子-胚胎母体相互作用的潜在介质[19]。输卵管小体包含一系列生物活性分子，如蛋白质、mRNA、lncRNA、脂质及基因组DNA，可以通过活性分子反映细胞生理及病理状态[20]。目前已在不同物种的输卵管液中分离出输卵管小体(小鼠[18]、牛[21]、人类[22]、狗[23]等)，并且对狗、鼠、牛3种输卵管小体的miRNA进行鉴定，发现2种共有的miRNA，即miR-30b和miR-375[24]，其中miR-375与氨基酸代谢、核苷酸代谢、糖代谢有关，并参与早期胚胎发育[23,25]。

2.2子宫小体 子宫小体于2008年由Griffiths等[26]首次在发情的小鼠子宫腔液中发现，已有学者证明子宫小体是由子宫内膜上皮细胞分泌[27]，其内部所包含的蛋白质是以周期性方式接受女性雌激素与孕激素的调节[28]。Greening等[29]研究表明，来自人子宫内膜上皮细胞的高度纯化的子宫小体蛋白组受类固醇激素调节，当雌激素主要作用时，子宫小体的蛋白质组富含与细胞膜骨架重组和信号级联反应相关的蛋白质，并参与子宫内膜修复。有研究表明，RNA、miRNA在子宫细胞外囊泡中选择性包装[30]。现已发现214个miRNA是子宫小体及其起源细胞所共有的，其中13个特异性miRNA选择性地包装在子宫小体中，并且参与了胚胎植入的重要途径，如细胞重塑、增殖及血管生成。有研究发现，子宫小体被人类HTR-8滋养层细胞转移内化，增强了黏附功能，部分通过激酶信号传导[29]，并检测到hsa-miR-30d，发现使用miR-30d处理小鼠胚胎可显著增加胚胎黏附性[31]。

2.3阴道小体 阴道小体于2018年首次于成熟发情小鼠阴道分泌液中发现[32]，其携带特征性生物标志物(CD9、CD81和HSC70)及精子调节蛋白(PMCAs和酪氨酸磷酸化蛋白)，其中精子调节蛋白对精子成熟与获能具有重要作用。有研究发现，女性阴道分泌液中的阴道小体对人类免疫缺陷病毒-1早期的生命周期具有抑制作用，可以使女性免受人类免疫缺陷病毒-1感染[33]。有学者发现，压力性尿失禁女性患者的阴道壁成纤维细胞所分泌的阴道小体具有抑制新生血管生成的作用，推测其可能在压力性尿失禁的病理过程中发挥重要作用[34]。

3 女性生殖道外泌体与精子成熟之间的相关作用

精子混合着精液在离开男性生殖道进入女性生殖道时，其与阴道、子宫内膜和输卵管环境相互作用，最终实现成功受精，但期间精子必须经历获能，即精子头膜经历一系列生化修饰，使精子到达卵母细胞的透明带时能够进行顶体反应，导致酶释放，允许精子穿透透明带与细胞质膜融合，而女性生殖道外泌体对精子功能连续编程起着重要作用[35]。

在精子进入女性生殖道后，大部分精子滞留于阴道，形成阴道栓。阴道黏膜分泌的外泌体可与精子相互作用，其中阴道小体可使精子细胞膜的PMCA4a与蛋白精子黏附分子-1显著增加，共同使精子进一步成熟、获能，增加受精能力[32]。PMCA4a是精子膜上主要的Ca2+外排泵，调节精子的Ca2+动态平衡。有研究表明，PMCA4a基因缺失可导致精子的进行性和过度活跃的运动性丧失，致雄性不育[36]。蛋白精子黏附分子-1是一种透明质酸酶，促使精子穿透卵丘基质和卵泡周围空间。子宫小体及输卵管小体在精子成熟与获能方面也起着重要作用，可以改变精子表面膜成分和新陈代谢，且均携带大量PMCA4a。有研究发现，小鼠输卵管小体PMCA4a形式比子宫小体的PMCA4a更有优势，并且与其他周期相比，在发情前期、发情期PMCA4a高度表达，输卵管小体通过整合素αvβ3和α5β介导与精子膜融合并将PMCA4a传递给精子，同时PMCA4a可以防止精子过早获能和支持精子受精潜力[32]。

4 女性生殖道外泌体与胚胎之间的相互作用

子宫小体在孕期滋养层细胞的产生中起着重要作用。Greening等[29]研究发现，人体子宫内膜来源的ECC1细胞系分泌的外泌体可被HTR-8滋养层细胞所摄取并增强黏附功能，并且与子宫小体共同培养1.5 h后，HTR-8滋养层细胞出现最大的黏附改变并维持4 h，更重要的是，与仅用雌激素处理的细胞(增殖期)相比，当亲本细胞用雌激素与孕激素处理以模拟接受性子宫内膜时，黏附率明显高于单独雌激素处理的细胞，且黏附刺激与子宫小体黏附分子含量的蛋白质组数据是一致的，其中纤维连接蛋白在HTR-8滋养层细胞中随着外泌体摄取而增加。此外，黏着斑激酶(FAK)途径各因子水平显著增加，表现为总FAK和磷酸化FAK蛋白的高水平表达，表明该途径可能参与了子宫小体摄取后HTR-8滋养层细胞黏附功能的增加[30]，并且FAK亦是胚胎囊泡、内细胞团和滋养外胚层细胞之间的细胞外囊泡通讯通路之一[28]。Ng等[30]认为，在精子植入前期，细胞外微环境内的部分子宫小体可以通过FAK信号传导来调节滋养层细胞黏附性。有研究报道，通过体外培养胚胎与牛输卵管小体时发现，胚泡可以主动摄取输卵管小体，并且在摄取之后明显改善胚泡质量，延长胚泡存活期，提高体外存活率和细胞、胚胎数量[21]。Lopera-Vasquez等[37]发现输卵管小体通过下调IFN-τ和PLAC8(与胚胎植入相关的基因)来改变胚胎的基因表达，从而改善胚胎发育和质量，并且该表达模式与体内胚胎类似。国外学者发现，小鼠输卵管小体可以改变体外培养胚胎细胞凋亡和细胞增殖相关基因(BAX、BCL-2、OCT-4)来抑制细胞凋亡和促进细胞分化，从而改善胚胎存活率[38]。

外泌体中含有多种金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶-14、金属蛋白酶-10。国外学者研究表明，基质金属蛋白酶-14、金属蛋白酶-10可以调节子宫小体不同因子的活性和生物利用度，进而影响胚胎和子宫内膜之间的相互作用[30,39]。有研究显示，基质金属蛋白酶-14、金属蛋白酶-10对促进胚胎植入和早孕有着重要的作用[28]。有研究报道，输卵管小体可以通过提高精子获能和受精能力，从而改善胚胎发育及低温抗性[18,22]，提高胚胎移植率和出生率[38]。有学者通过牛输卵管小体质谱分析鉴定了336个蛋白质簇，发现多种蛋白对受精及早期胚胎发育起着至关重要的作用[24]，并且在排卵后期有助于精子从精子库中释放，并使精子过度活化、运输，以满足卵母细胞受精和早期胚胎发育[24,40]。

5 展望

女性生殖道外泌体作为精子与女性生殖道及胚胎与母体之间的直接和间接的交流方式，通过介导一系列外泌体的分子机制来研发女性生殖道新的调节剂，并通过对外泌体内部miRNA的进一步探索，有助于实现新的纳米治疗与纳米诊断，使得外泌体在女性生殖能力方面具有一定的诊断和治疗潜力。