睾丸精子混悬液冻融的临床结局及不同冻融载体的应用效果▲

李超强 朱凯欣 冯兰青 蔡 冠 吴亚敏 伍春蓉

(中山大学附属东华医院1 生殖医学科，2 检验科，广东省东莞市 523110， 电子邮箱：donghualcq@126.com)

梗阻性无精子症患者的睾丸生精功能正常，但由于输精管道梗阻使其精液中未见精子。部分患者可经药物或显微外科吻合术治疗后自然生育，部分患者则需卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治疗才有可能生育。ICSI前需抽取睾丸组织进行组织混悬液或组织病理学检查，以观察其内是否有可使用精子[1]。睾丸组织抽取具有创伤性，若能将诊断性抽取到的精子混悬液有效地冻存，用于取卵日授精，可将诊断与治疗相互结合，减少对患者不必要的创伤。但睾丸组织精子数量少、活动力差时，常规冻融精子回收率及存活率低[2]。研究表明，影响精子冻融效果的主要因素有精子冻存液、冻融方法及冷冻载体，临床上精子冻存液已商品化，成分固定，而冻存方法多用手工法[3]，因此冷冻载体成为决定睾丸精子冻融存活率高低的关键。近年来，有多项微量载体应用于冷冻睾丸精子的研究报告[4-5]，但未见有关超微量薄片与超微量麦管的应用效果比较。故本研究采用超微量冷冻薄片和超微量冷冻麦管对睾丸诊断性穿刺获得的精子混悬液进行冷冻，分析睾丸精子混悬液冻融的临床结局，并比较应用两种冻融载体的睾丸精子的效果以及胚胎结局，旨在寻找更高效的睾丸精子冻融载体。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2017年1月至2019年7月在我院生殖医学科因梗阻性无精子症行ICSI治疗的患者共197例。纳入标准：符合梗阻性无精子症的诊断标准。排除标准：女方患有子宫畸形、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、输卵管积水；女方成熟卵子数<8枚；女方年龄>38岁；女方月经周期不规律，月经第3天血促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)≥10U/L；双方染色体核型异常。其中43例患者行睾丸精子冷冻ICSI治疗(冷冻组)，154例行睾丸新鲜精子ICSI治疗(新鲜组)。43例睾丸冷冻精子分为两等份，分别使用超微量冷冻麦管(麦管组)和超微量冷冻薄片(薄片组)作为载体进行冷冻，将同一患者配偶卵子分为两组(所获卵子数为偶数时均分入两组，为奇数时随机分组)，分别与复苏后的麦管组、薄片组精子进行ICSI。所有研究对象均对本研究知情同意，本研究获得中山大学附属东华医院的伦理委员会批准(批件号:2017DHLL037)。

1.2 相关标准

1.2.1 梗阻性无精子症诊断标准[6]：(1)≥2次精液标本(相隔2周以上)离心前后均未找到精子；(2)睾丸活检符合梗阻性无精子病理学表现。

1.2.2 精子冷冻条件：睾丸组织混悬液在200倍倒置显微镜下每视野发现≥1条活动精子。

1.3 主要试剂和载体 G-IVF PLUS 洗精受精液购自瑞典Vitrolife公司，培养油购自瑞典Vitrolife公司，精子冻存液购自美国Irvine公司，25 μL超微量冷冻薄片载体购自上海辛菖医疗器械有限公司，50 μL超微量冷冻麦管购自上海郜鸿生物科技有限公司。

1.4 治疗方法

1.4.1 睾丸诊断性穿刺：患者取截石位，常规消毒、铺巾，采用2%利多卡因局部麻醉后，用10 mL无菌注射器缓慢刺入睾丸，缓慢回抽，注射器内吸入少量曲细精管后迅速撤针，将穿刺获得的睾丸组织分为两等份，其中一份送病理检查，另一份置于装有3 mL G-IVF PLUS 洗精受精液的培养皿内，立即送至胚胎培养室进行处理。

1.4.2 睾丸精子冷冻

1.4.2.1 睾丸精子冷冻前处理：将穿刺抽取到的睾丸生精小管组织用G-IVF PLUS 洗精受精液洗涤3次后，放入盛有50 μL G-IVF PLUS 洗精受精液的平皿中，室温下用2支无菌1 mL BD注射器针头快速撕碎生精小管，镜检精子情况，若符合冷冻标准，把精子混悬液吸入离心管中，然后加G-IVF PLUS 洗精受精液至1 mL。37℃、6%CO2孵育3 h后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，留沉淀0.03 mL，加入0.02 mL精子冻存液混匀，平均成两份，在200倍倒置镜下迅速计数薄片载体10个视野活动精子数。

1.4.2.2 不同载体睾丸精子冻融：(1)超微量冷冻麦管冻融。用1 mL注射器接上麦管口，麦管尖端置于睾丸精子混悬液中，吸入混悬液后去掉注射器后封住麦管两端，依照临床诊疗指南的操作规程[3]进行麦管冷冻。取卵日取出冻存麦管，用纱布擦去麦管上冰霜后迅速置于37℃水浴箱中复温30 s；取出麦管用无菌纱布擦去麦管表面水珠，用无菌剪刀剪开麦管尖端，管口接上1 mL注射器，把麦管中混悬液推注于显微穿刺皿的圆圈内，盖上37℃培养油孵育30 min，在200倍倒置镜下计数10个视野活动精子数。(2)超微量冷冻薄片冻融：将混悬液平铺于冷冻薄片的冷冻圈上，依照临床诊疗指南的操作规程[3]进行薄片冷冻。取卵日取出冷冻薄片，立即插入盛有37℃培养油的显微穿刺皿中孵育30 min，在200倍倒置镜下计数10个视野活动精子数。

1.4.3 睾丸新鲜精子行ICSI前处理：取卵日时男方进行睾丸穿刺取精，将抽取到的生精小管用G-IVF PLUS 洗精受精液洗涤3次后，放入盛有50 μL G-IVF PLUS 洗精受精液的平皿中，室温下用2支无菌1 mL BD注射器针头快速撕碎，将精子混悬液吸入15 mL离心管中加G-IVF PLUS 洗精受精液至1 mL，37℃、6%CO2孵育3 h，1 000 r/min离心5 min，弃上清，留沉淀0.03 mL备用。

1.4.4 促排卵方案：采用标准黄体期长效长方案，黄体中期皮下注射注射用醋酸曲普瑞林(法国益普生公司，3.75 mg/安瓿)进行降调，使用剂量根据患者体重、年龄、窦卵泡数目、基础性激素水平及既往治疗周期用药情况制定。达到降调标准后，给予150 IU/d注射用重组人FSH(果纳芬，瑞士雪兰诺公司)皮下注射和75 IU/d注射用尿促性素(珠海丽珠制药)肌肉注射进行促排卵。降调标准:月经来潮第3～5 d，B超监测子宫内膜厚度≤5 mm，所有卵泡直径≤5 mm，血雌二醇<50 pg/mL，FSH<5 IU/L、黄体生成素<5 IU/L；直径≥4 mm的窦卵泡数占总窦卵泡数的60%以上。当患者优势卵泡直径≥18 mm时，当晚肌内注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)10 000U(珠海丽珠制药)，34～36 h后在阴道B超引导下穿刺取卵术，于体视镜下收集卵子。

1.4.5 ICSI授精及胚胎评分：hCG注射后39～40 h去除卵子颗粒细胞，依据研究分组分别用新鲜精子、两种载体冻融复苏的存活精子进行ICSI。ICSI后(17±1)h(D1)卵子有双原核为正常受精，受精后(44±1)h(D2)、(68±1)h(D3)进行胚胎评分。参照《人类体外受精-胚胎移植实验室操作专家共识(2016)》，根据卵裂球数目、卵裂球均匀程度和碎片率等进行卵裂期胚胎评分，优质卵裂期胚胎评定标准为D1为双原核，D2卵裂球无多核，D3卵裂球数为7～9个，大小较均匀，形状规则，碎片≤20%；按Gardner囊胚分级法进行囊胚期胚胎评分，即根据囊胚发育阶段、内细胞团和滋养层细胞的综合情况来评定，囊胚发育分为6个时期(1～6期)，对于3～6期的囊胚，还需对其内细胞团细胞和滋养层细胞进行A、B、C 3个级别的分级。

1.4.6 移植及妊娠判定：移植胚胎来源不区分麦管载体还是薄片载体，数量≤3枚。胚胎移植5周后B超下检查孕囊，有孕囊为临床妊娠。

1.5 观察指标 (1)记录冷冻组和新鲜组获卵数、成熟卵子率、移植胚胎数、受精情况(正常受精率和优质胚胎率)、妊娠结局(种植率、周期临床妊娠率和流产率)，冷冻组的结果为麦管组与薄片组的合并数据。其中，正常受精率=正常受精卵数/注射MⅡ卵数×100%，优质胚胎率=优质卵裂期胚胎数/正常受精卵数×100%，种植率=宫内及宫外孕囊总数/移植胚胎数×100%，周期临床妊娠率=周期临床妊娠数/周期数×100%，流产率=早期流产周期数/周期临床妊娠数×100%。(2)比较麦管组、薄片组活动精子回收率、正常受精率、卵裂率、胚胎利用率和优质胚胎率。其中，活动精子回收率=复苏后活动精子数/冷冻前活动精子数×100%，卵裂率=受精卵裂数/正常受精卵数×100%，胚胎利用率=(双原核冷冻胚胎数+双原核移植胚胎数)/正常受精卵数×100%。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 冷冻组和新鲜组一般资料的比较 两组男方年龄、两组女方年龄、体质指数、不孕年限、基础激素水平、hCG日激素水平及内膜厚度、促性腺激素(gonadotropin，Gn)使用天数和总量相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 新鲜组与冷冻组一般资料的比较(x±s)

2.2 冷冻组和新鲜组受精情况及妊娠结局的比较 两组成熟卵子率、正常受精率、优质胚胎率、种植率、周期临床妊娠率和流产率相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

2.3 两种不同冻融载体的睾丸精子冻融效果和胚胎结局的比较 冷冻组冷冻前活动精子数为(10.74±2.59)个，两种载体冷冻复苏后均能找到活动精子，并满足卵子受精使用，麦管组、薄片组活动精子数分别为(4.16±1.27)个、(5.12±1.53)个。麦管组活动精子回收率低于薄片组(P<0.05)，但两组的正常受精率、卵裂率、胚胎利用率和优质胚胎率差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 两种不同冻融载体的睾丸精子冻融效果和胚胎结局的比较

3 讨 论

2015年，我国ICSI的临床妊娠率约为50.0%[7]。在无精子症患者的睾丸或附睾中找到活动精子是ICSI 治疗的关键。研究显示，不同人群经皮睾丸精子抽吸术一次性活检能找到精子的概率存在差异：在梗阻性无精子症患者中约为86.0%，而在非梗阻性无精子症患者中约为29.5%[8]。故梗阻性无精子症患者行ICSI治疗时也面临反复睾丸穿刺取精的可能，或妊娠失败后还需进行多次睾丸穿刺取精。所以，简单、安全地冷冻睾丸诊断性检查穿刺获得的精子或ICSI治疗剩余的精子，其复苏后的活动率高、受精率正常、胚胎质量及妊娠结局好，成为精子高效冻融的目标与研究方向。

精子冻融会改变精子形态、精子质膜以及增加DNA损伤[9]，关于睾丸冷冻精子的受精能力，各研究的结果不尽相同。Roque等[10]研究发现，冻融睾丸精子受精率为67.9%；Sun等[5]研究发现，非梗阻性无精子症患者冻融睾丸精子受精率为73.0%，卵裂率为86.0%；Yu等[11]的研究结果显示，睾丸新鲜精子与睾丸冷冻精子受精率分别为73.4%、71.4%，优质胚胎率分别为54.5%、55.3%，囊胚形成率分别为60.1%、60.9%，各指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究中，睾丸冷冻精子的正常受精率和优质胚胎率分别为80.21%、40.09%，而睾丸新鲜精子为79.04%、40.23%，两者的受精能力和胚胎质量相似(P>0.05)。睾丸精子由于缺少输精管及精浆作用而成熟度差，经过冻融的不良因素的作用后，胚胎后期发育及种植能力尚无统一定论。有文献显示，睾丸冻融精子形成的胚胎种植能力降低、流产风险增加[12]；但也有研究表明睾丸冷冻精子与睾丸新鲜精子的妊娠结局相似[13-14]。本研究中，睾丸冷冻精子和新鲜精子的受精情况及妊娠结局差异无统计学意义(均P>0.05)，但睾丸冷冻精子的种植率和周期临床妊娠率稍低于睾丸新鲜精子，而流产率稍高于新鲜精子。由于本研究冷冻组的例数仅为43例，样本量小，且并未能区分不同载体进行分析，所得结果可能存在偏倚，睾丸冻融精子的妊娠结局是否与睾丸新鲜精子存在差异，仍需多中心大数据研究进一步论证。

目前临床上的睾丸精子冻融载体有微量麦管、微量薄片、冷冻麦管、冷冻环和ICSI针管等，采用合适的冷冻载体行精子冻融后活动精子回收率高，对于成熟卵子数多的病例以及缩短ICSI体外操作时间非常有利。研究表明，薄片类载体冻融操作简单，且能获得较高的精子回收率及存活率。Sun等[5]使用新型薄片载体冷冻睾丸精子，精子回收率为83.0%，活动率为47.5%；Coetzee等[15]使用Cell Sleeper薄片类载体冷冻睾丸精子，存活率约为58.8%。此外，也有学者认为，微量麦管也能获得较高的精子回收率及存活率。王乃辉等[16]使用超微量冷冻麦管冷冻睾丸精子，精子复苏率为86.96%，活动率为40.2%；Liu等[17]使用微量麦管冻融微量精子，其活动率为38.5%。本研究使用超微量冷冻麦管和超微量冷冻薄片分别冷冻诊断性睾丸精子混悬液，解冻后两载体的活动精子均能满足受精所需，薄片组活动精子回收率为47.62%，麦管组为38.74%，与其他研究报告的结果相似[5,16]。本研究挑选复苏后形态正常且活力好的精子分别行ICSI，两组的正常受精率、卵裂率及优质胚胎率差异均无统计学意义(均P>0.05)，即两载体有相似的受精率及胚胎质量；但薄片组活动精子回收率优于麦管组(P<0.05)，由此可见，同等胚胎结局下超微量冷冻薄片在提高睾丸精子冻融后活动率方面具有优势。精子冻融过程是一个筛选过程，只有活力好、顶体膜功能稳定的精子才能经受住低温作用而得以存活，且复苏精子的活动力与精子DNA碎片升高率呈负相关[18]。薄片载体采用原位冷冻解冻，混悬液不需要移位，减少因操作原因导致的精子丢失；同时冷冻的精子混悬液平铺于薄片载体，增加了冻融表面积，提高了冻融温度变化速率，减少精子冻融损伤。

综上所述， 采用睾丸冷冻精子与睾丸新鲜精子行ICSI有相似的临床结局，其中使用超微量冷冻薄片对睾丸精子混悬液进行冻融可获得较好的效果。睾丸精子虽然具有受精及卵裂所需的中心粒及相关因子，但缺乏精子正常成熟过程，睾丸精子冻融的远期安全性仍需长期地随访研究。