绿原酸对小鼠巨噬细胞向M2型活化的促进作用及机制▲

朱智德 王庆高 韩景波 窦维华 蒋志雄 陈 炜,3

(1 广西中医药大学博物馆，南宁市 530001，电子邮箱：gxzhuzhide@163.com；2 广西中医药大学第一附属医院心血管科，南宁市 530023；3 广西中医基础研究重点实验室， 南宁市 530200)

病毒性心肌炎是指由病毒感染引起的局限性或弥漫性心肌炎性病变，是目前各种原因引起的心肌炎中发病率最高的类型之一[1]。柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus B3，CVB3)是病毒性心肌炎的主要致病因素[2]。近年研究显示，替代活化途径的巨噬细胞又称M2型巨噬细胞，在巨噬细胞所致的急性炎症过程中起重要的负向调控作用[3-4]。M2型巨噬细胞在急性感染时期可以减少促炎细胞因子的产生，从而阻止急性炎性损害[5-6]。绿原酸又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸与奎尼酸合成的缩酚酸，属于苯丙素类化合物。现研究已发现绿原酸具有心血管保护、抗诱变及抗癌、抗菌及抗病毒、降脂、抗白血病、免疫调节、降糖等多种药理学活性，但绿原酸是否能通过调控巨噬细胞活化，起到控制炎症反应，促进干扰素分泌的作用，仍有待探索。本研究拟通过探索绿原酸对CVB3介导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞活化途径的影响，明确绿原酸激活M2巨噬细胞活化的机制，为进一步开发有效治疗急性病毒性心肌炎的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 RAW 264.7小鼠巨噬细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。杜氏改良依格尔培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸细胞消化液、青/链霉素细胞培养添加剂等细胞培养用试剂均购自美国Gibco公司(批号：11965092、10010023、12483020、25200072、15240062)，绿原酸(批号：C3878)等生化试剂均购自美国Sigma公司，β-肌动蛋白(β-actin)(批号：ab8227)，信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)6及Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG H&L(二抗)均购自英国Abcam公司(批号：ab32520、ab215036、ab6721)，Fizz1、转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)及血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司(批号：MM-0837M1、MM-45041M1、MM-0070M1)，细胞计数(cell count kit 8，CCK-8)检测试剂盒(批号：CA1210)、RNA提取试剂(批号：R1100)、反转录试剂(批号：RP1100)、PCR扩增试剂(批号：SR1110)均购自中国Solarbio公司，RIPA蛋白提取试剂(批号：R0010)、ECL电化学发光试剂盒(批号：PE0010)等免疫印迹实验所使用相关试剂及耗材均购自中国Solarbio公司。CVB3购自北纳生物(批号：BNCC170424)。PCR检测所用引物由上海生工合成。

1.2 细胞活力检测 将RAW 264.7细胞置于37℃、5% CO2条件下培养，每2 d换液一次，取对数生长期RAW 264.7细胞，消化后将细胞接种于96孔板中，接种密度为5×103个/孔，加入不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)绿原酸，于37℃、5% CO2条件下培养2 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，于酶标仪上读取A450的A值，依照公式计算各组细胞活力：细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100%。

1.3 细胞分组及干预 将RAW 264.7细胞置于37℃、5% CO2条件下培养，每2 d换液一次，细胞生长至对数期后将细胞铺至12孔板，待细胞汇合度至75%时进行后续干预操作。将细胞分为空白对照组、CVB3刺激组、CVB3刺激+绿原酸低剂量组、CVB3刺激+绿原酸中剂量组、CVB3刺激+绿原酸高剂量组。其中，CVB3感染剂量为107TCID50/L，药物干预组细胞经CVB3干预24 h后再根据分组给予药物干预；绿原酸粉末溶于二甲基亚砜，储液浓度为10 mg/mL，按照实验浓度要求每组添加相应浓度绿原酸，其中低剂量、中剂量、高剂量分别为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。空白对照组加入1%二甲基亚砜作为溶剂对照。药物干预期间将细胞置于37℃，5% CO2环境下培养，培养72 h后收集细胞上清液及细胞进行后续实验，实验重复3次。

1.4 实时PCR检测 干预72 h后，收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，进行PCR体系配比，反应体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F(10 μM) 1μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，cDNA 2μL，ddH2O 8.5 μL。于ABI 7500荧光定量PCR仪上进行扩增反应(热启动95℃，10 min；变性95℃，10 s；退火/延伸60℃，35 s，共40个循环；溶解曲线分析)。获得实验数据，以β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参，经2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。引物序列如下：β-actin上游引物5′-CCACCATGTACCCAGGCATT，下游引物5′-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3′；白细胞介素13 α1受体(interleukin 13 receptor α1,IL-13Rα1)上游引物5′-ACTATTGGAGCACGGCACAA-3′，下游引物5′-TCCCAGCTGCAAGCTGATAC-3′；白细胞介素4α受体(interleukin 4 receptor α,IL-4Rα)上游引物5′-TCTACTATACGGCGCGTGTG-3′，下游引物5′-ATTCCCGTGAGCTCTCCTCA-3′；STAT6上游引物5′-GTGTGAAAGCCTGGTGGAAAT-3′，下游引物5′-GGACTTCATCCAGACGGCTT-3′；KLF4上游引物5′-CGATGAACTGACCAGGCACT-3′，下游引物5′-CCATGATTGTAGCGCTTGCC-3′。

1.5 免疫印迹实验检测 干预72 h后，收集各组细胞，依照RIPA蛋白提取试剂盒说明书操作步骤提取细胞总蛋白，并进行变性处理。蛋白定量后进行二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，电泳结束后将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜上，经8%脱脂奶粉在24℃下封闭2 h后，置于4℃条件下孵育一抗(STAT6、KLF4、β-actin稀释比例分别为1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶5 000)12 h，经PBST洗脱，再于37℃下孵育对应二抗(稀释比例1 ∶10 000)2 h，后使用ECL电化学发光试剂盒，于Tanon 5200多功能成像仪(上海天能)上进行曝光成像。使用Image J软件读取各组光密度值，目的蛋白光密度值/内参蛋白光密度值即为蛋白相对表达量。

1.6 ELISA检测 干预72 h后，取细胞上清液，在4℃下经3 000 r/min离心5 min后，根据Fizz1、TGF-β及PDGF的ELISA检测试剂盒说明书，设置标准曲线、空白对照及样本检测孔，经酶联免疫吸附及抗体结合、化学显色等步骤，使用FilterMX F5型多功能酶标仪(MD公司)在A450处读取A值，根据标准曲线计算各组各指标表达量，进行作图及数据统计分析。

1.7 统计学分析 使用GraphPad Prism软件进行数据制图，SPSS 25.00软件进行数据统计及分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 绿原酸对RAW 264.7细胞活性的影响 分别使用不同浓度绿原酸干预细胞后，RAW 264.7细胞半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC50)为285.2 μg/mL。在≤100 μg/mL的药物浓度干预下，细胞可保持80%以上活力，药物浓度>200 μg/mL时，细胞活力显著降低，见图1。

图1 各浓度绿原酸干预下RAW 264.7细胞活性

2.2 绿原酸对RAW 264.7细胞分泌炎症因子及生长因子的影响 与空白对照组相比，CVB3刺激组和CVB3刺激+绿原酸低剂量组细胞上清液中Fizz1相对表达量降低，TGF-β及PDGF相对表达量升高(均P<0.05)，CVB3刺激+绿原酸中剂量组细胞上清液中TGF-β相对表达量亦升高(P<0.05)，但CVB3刺激+绿原酸高剂量组各因子相对表达量与空白对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。与CVB3刺激组相比，CVB3刺激+绿原酸中剂量组、CVB3刺激+绿原酸高剂量组细胞上清液中Fizz1相对表达量升高，且CVB3刺激+绿原酸高剂量组细胞上清液中TGF-β及PDGF相对表达量降低(均P<0.05)。见表1。

表1 5组RAW 264.7细胞上清液Fizz1、TGF-β及PDGF相对表达量对比(x±s)

2.3 绿原酸对RAW264.7细胞替代途径活化相关因子mRNA及蛋白表达的影响 与空白对照组相比，CVB3刺激组和CVB3刺激+绿原酸低剂量组的IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相对表达水平均降低(均P<0.05)，CVB3刺激+绿原酸中剂量组IL-13Rα1、STAT6、KLF4 mRNA以及KLF4蛋白的相对表达水平亦降低(均P<0.05)。与CVB3刺激组相比，CVB3刺激+绿原酸中剂量组和CVB3刺激+绿原酸高剂量组IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相对表达水平均升高(均P<0.05)，其中除IL-13Rα1 mRNA以及KLF4蛋白的相对表达水平外，CVB3刺激+绿原酸高剂量组其他因子mRNA及STAT6蛋白的相对表达水平与空白对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2和图2。

表2 5组RAW 264.7细胞相关因子mRNA及蛋白表达水平的对比(x±s)

图2 5组RAW 264.7细胞STAT6及KLF4蛋白表达情况

3 讨 论

病毒性心肌炎临床表现不一，严重者出现进行性心脏扩大、心力衰竭等情况，8%～12%的患者会出现猝死[7]，疾病谱的复杂性使其诊断和治疗成为临床上的一大难点。病毒感染引起心肌炎的机制尚不十分明确，目前普遍认为主要的机制为病毒直接损害心肌以及病毒感染后机体自身的免疫反应引起损伤，与机体的过度炎症反应关系密切[8]。病毒进入心肌细胞后，进行复制的同时表达病毒蛋白并释放病毒颗粒，而巨噬细胞吞噬病毒颗粒，释放相关因子并提呈抗原，启动体液及细胞免疫，在局部释放出炎性因子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等)，故其在清除病毒的同时也加剧心肌的炎症反应[9]。这种紊乱可能会导致持续性心肌损伤，从而使病情进一步恶化[10]。因此，在病毒性心肌炎的急性进展过程中，控制过强的炎症反应，是避免心脏组织进行性损害、降低急性期死亡率的一种可行性手段。使用免疫球蛋白和免疫抑制剂等免疫调节剂治疗病毒性心肌炎是目前主流的方法[11-12]，但存在价格昂贵、货源不稳定、药理作用机制不明确等缺点[13]。因此，临床迫切需要一种在病毒性心肌炎急性期控制过强免疫反应，但又不会明显抑制机体免疫功能的药物。

巨噬细胞可被极化为两个亚群，分别为经典途径活化的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代途径活化的巨噬细胞(M2型巨噬细胞)[3]，其中M1型巨噬细胞和经典的炎症反应密切相关，而M2型巨噬细胞在急性感染时期能减少促炎细胞因子的产生，从而阻止急性炎性损害[4]。因此，如果在病毒感染的早期采用有效的方法调控M2型巨噬细胞，则将能有效控制急性病毒性心肌炎患者心功能的进行性恶化[14-15]。巨噬细胞表面的IL-4Rα/IL-13Rα1复合体可与IL-13结合，启动巨噬细胞替代活化途径，促进其下游STAT6表达，抑制STAT1活性，避免巨噬细胞向经典途径活化，并诱导生成KLF-4等细胞因子，协同抑制NF-κB p50/p65复合体生成，并促进Fizz1表达及胶原沉积，从而阻止过强的炎症反应产生[16-17]。本研究中，RAW 264.7小鼠巨噬细胞经CVB3刺激后，细胞上清液中Fizz1表达降低而TGF-β、PDGF表达升高，且IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相对表达水平均降低，这表明RAW 264.7细胞呈向M2型分化的趋势。

绿原酸广泛存在于植物中，以金银花、杜仲中的含量较高，具有广泛的药理作用。本研究结果表明，在体外培养RAW 264.7细胞过程中添加绿原酸，药物浓度≤100 μg/mL时细胞活力无显著降低现象，因此后续实验的药物干预浓度均未超过100 μg/mL。经高剂量绿原酸干预后，与CVB3刺激组比较，RAW 264.7细胞上清液中Fizz1相对表达量升高而TGF-β及PDGF相对表达量降低(P<0.05)，且这些细胞因子表达量与空白对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)；此外，替代途径活化相关因子mRNA及蛋白表达水平均较CVB3刺激组升高(P<0.05)，其中IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6蛋白与空白对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。这表明高剂量绿原酸可抑制经典炎症活化途径，使得RAW 264.7细胞向M2型分化，并可抑制巨噬细胞分泌炎症因子。然而，经低剂量的绿原酸干预后RAW 264.7细胞中的外泌细胞因子和替代途径活化相关因子的表达并无明显变化，而经中剂量的绿原酸干预后RAW 264.7细胞中的大部分上述因子的表达有所改善，但未达到空白对照组水平，因此100 μg/mL的高剂量绿原酸干预效果较好。

综上所述，在体外培养RAW 264.7细胞的过程中，100 μg/mL的高剂量绿原酸可逆转由CVB3介导的巨噬细胞向M2型分化，并抑制炎症因子的分泌，从而降低炎症水平。因此推测，绿原酸可抑制病毒性心肌炎引发的体内炎症反应恶性循环，达到阻断过强炎症反应的目的，有望成为抑制病毒性心肌炎急性期免疫反应的临床药物。