Beclin1和Ki67在肺腺癌组织中的表达及其临床意义▲

张秀玲 庞 晨 叶星江 刘姗姗 张锡流

(广西中医药大学第一附属医院病理科，南宁市 530001，电子邮箱：414845910@qq.cm)

肺癌是世界各国常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率位居恶性肿瘤之首[1-2]，其也是广西高发的恶性肿瘤之一[3]，且发病率有逐年增长之势[4]。肺腺癌早期症状隐匿，不易发现，发现时已多为晚期，并伴多部位转移[5]。自噬与肿瘤的发生和发展关系密切，是目前的研究热点。Beclin1是自噬的重要调控因子，可调节细胞内自噬活性[6]。研究显示，Beclin1蛋白在肺腺癌组织中表达，但其表达水平不一致，且机制未明[7-8]。Ki67是判断细胞增殖能力的重要指标，其阳性表达率与肿瘤细胞增殖活跃程度密切相关[9]，并且临床上已将其作为重要的肿瘤风险评估指标，用于判断肿瘤的进展、恶性程度等，具有重要的生物学意义及临床意义[10]。Beclin1与Ki67在肺腺癌中的表达关系如何，还未见相关报道。本研究探讨自噬相关蛋白Beclin1与Ki67在肺腺癌中的表达及其临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年10月至2019年10月在广西中医药大学第一附属医院进行手术的100例肺腺癌患者的癌组织标本及相应的癌旁组织标本。纳入标准：初诊患者且临床资料完整。排除标准：手术前接受过放疗、化疗等抗癌治疗；合并其他恶性肿瘤等。记录肺腺癌患者的临床资料，包括性别、年龄、肿瘤-淋巴结-远处转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况、远处转移情况。本研究经医院医学伦理委员会审核并获得批准。

1.2 主要仪器及试剂 HH-B11型电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；BCD-227B型立式冷藏柜(青岛海尔股份有限公司)；BX41-SD02光学显微镜(Olympus公司)。鼠抗人Ki67单克隆抗体(一抗/即用型，福建迈新公司，批号：1907170672h、190704S407b)；Beclin1单克隆抗体(一抗，美国Abcam公司，批号：GR3204186-2)；即用型快捷免疫组化MaxVision-HRP鼠/兔(通用二抗，福建迈新公司，批号：190704S407b)。

1.3 免疫组化法检测Beclin1与Ki67的表达 将肺腺癌组织标本及癌旁组织标本用10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋及并制作切片(厚度4 μm)，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-peroxidase,SP)法检测癌组织及癌旁组织的Beclin1蛋白表达和Ki67增殖指数情况。先使用多聚赖氨酸防脱载玻片贴4 μm石蜡切片，75℃烤片30 min，再将切片脱蜡至水；加入一定量的pH 6.0柠檬酸缓冲液(液面高过切片为度)，加温至沸腾进行抗原热修复；冷却后，将组织切片置于3% H2O2水溶液中15～20 min以阻断内源性过氧化物酶，用磷酸盐缓冲液冲洗3次(1 min/次)；滴加适当稀释的一抗[Beclin1(1 ∶80)、ki67抗体(即用型)]，37℃孵育90～120 min，4℃过夜后用磷酸盐缓冲液冲洗3次(3 min/次)；滴加二抗37℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次(5 min/次)；二氨基联苯胺显色3～10 min，显微镜下监控显色程度，水洗终止显色，之后进行苏木精复染、1%盐酸酒精分化、饱和碳酸锂水溶液返蓝、梯度酒精脱水、透明，最后封片观察。

1.4 结果判读 由两位主治医师以上级别病理科医生独立阅片。如果两位医生阅片结果不一致，则协商确定结果。

1.4.1 Beclin1蛋白：该蛋白主要表达于肺腺癌细胞胞质，阴性细胞呈淡黄色、黄色或棕黄色颗粒。光学显微镜下随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞；根据细胞染色评分和阳性细胞百分比评分乘积判断Beclin1的表达情况[11]。(1)细胞染色评分。无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。(2)阳性细胞百分比评分。无阳性细胞为0分，阳性细胞百分比<10%为1分，阳性细胞百分比10%～49%为2分，阳性细胞百分比50%～74%为3分，阳性细胞≥75%为4分。计算细胞染色评分与阳性细胞百分比评分的乘积，乘积≤3分为阴性表达，乘积>3分为阳性表达。

1.4.2 Ki67：Ki67表达于肺腺癌细胞细胞核中，阳性表达为棕黄色。光学显微镜下随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞；细胞无染色为阴性(-)，阳性细胞百分比<10%为弱阳性(1+)，阳性细胞百分比10%～49%为阳性(2+)，阳性细胞数≥50%为强阳性(3+)[12]。

1.5 统计学分析 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验或秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Beclin1蛋白在癌组织及癌旁组织的表达情况 Beclin1蛋白表达于肺腺癌细胞胞质，呈浅黄色至棕黄色颗粒，见图1。100例癌组织中，Beclin1蛋白阳性79例，阳性表达率为79%；100例癌旁组织中，Beclin1蛋白阳性23例，阳性表达率为23%。癌组织Beclin1阳性表达率高于癌旁组织(χ2=62.745，P<0.001)。

图1 Beclin1在癌组织及癌旁组织中的表达(SP染色，×400)

2.2 癌组织Beclin1蛋白表达情况与患者临床病理特征的关系 不同Beclin1蛋白表达情况的患者之间年龄、性别、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移比例及远处转移比例比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 癌组织Beclin1蛋白表达情况与患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 癌组织中Beclin1蛋白表达阳性和阴性患者间Ki67表达情况的比较 79例Beclin1蛋白阳性的癌组织中，Ki67强阳性16例，阳性47例，弱阳性或阴性16例；21例Beclin1阴性的癌组织中，Ki67强阳性3例，阳性7例，弱阳性或阴性11例。Beclin1蛋白阳性的癌组织中Ki67表达水平高于Beclin1蛋白阴性的癌组织(z=2.356，P=0.019)。

3 讨 论

自噬是真核细胞中细胞初级溶酶体处理内源性底物的分解过程，对于维持细胞内环境稳定和蛋白代谢平衡均有十分重要的作用[6]。研究表明，自噬不仅是细胞自我保护的一种方式，在一定条件下也可诱导细胞凋亡[14]；而与此同时，自噬可抑制凋亡的发生，其通过清除受损细胞器或蛋白，为细胞重新供能，使细胞免于凋亡[6]。Beclin1基因位于人类染色体17q21，主要定位于细胞质结构，如内质网和线粒体[13]。Beclin1是首个被鉴定出来的介导哺乳动物自噬的基因，在细胞自噬的调控中起到关键作用；其可招募自噬关键蛋白到自噬体前体，与Vps34和ps15形成复合物，参与自噬的早期阶段，促进自噬囊泡的成核，并从胞质中吸收蛋白质[15]。因此，Beclin1的异常表达可引起自噬和凋亡分子通路受损，从而导致恶性肿瘤发生[16-17]。

不同的研究中，肺腺癌组织Beclin1蛋白阳性率存在差异：张秀义等[8]报告肺腺癌组织Beclin1蛋白阳性率为30.43%：董桂兰等[11]报告肺腺癌组织Beclin1蛋白阳性率为51.2%；Wang等[18]报告肺腺癌组织Beclin1蛋白阳性率为46.15%。本研究结果显示，Beclin1蛋白主要表达于肺腺癌细胞细胞质中，且癌组织Beclin1蛋白阳性表达率为79%，高于癌旁组织(P<0.05)，也明显高于上述研究结果，与孙雪丽等[19]报告的肺腺癌组织Beclin1蛋白阳性率(86.36%)相近，但与杜海磊等[7]报告的研究结果(肺腺癌癌组织Beclin1蛋白阳性表达率低于癌旁组织)相反。在本研究中，Beclin1蛋白表达情况可能与肺腺癌患者的临床病理特征(年龄、性别、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况及远处转移情况)无关，与孙雪丽等[19]的研究结果相似。但相关研究显示，肺腺癌患者Beclin1蛋白表达情况与其肿瘤分化程度[8，18]、TNM分期[11]、临床分期[7]、淋巴结转移情况[7-8，18]、吸烟[18-19]、性别[18]相关。造成这些差异的原因可能与研究样本量、纳入标准、检测方法、标本固定处理方法不同有关。

Ki67是判断细胞增殖能力的重要指标，其阳性表达率与肿瘤细胞增殖活跃程度密切相关[9]。因Ki67的半衰期短，临床上已将其作为评估肿瘤风险的重要指标，用于判断肿瘤的进展、恶性程度等，具有重要的生物学意义及临床意义[10]。本研究结果显示，肺腺癌癌组织Beclin1蛋白阳性患者的Ki67表达水平高于癌组织Beclin1蛋白阴性的患者(P<0.05)，提示Beclin1或可通过促进肿瘤细胞增殖分裂，参与肺腺癌的发生和发展。但因本研究样本量有限，相关研究结论有待大样本研究进一步证实。

综上所述，自噬相关基因Beclin1在肺腺癌组织中高表达，且在Beclin1高表达的肺腺癌组织中Ki67也高表达。由此推测，Beclin1蛋白促进肺腺癌细胞增殖分裂，从而参与肺腺癌的发生和发展，其有望成为判断肺腺癌恶性程度的生物学指标。