基于冷冻切片的直接免疫组化染色法在甲状腺乳头状癌中的诊断价值

刘凤磊，何 欣，梁小芹，常守凤，王金穗，温丽萍，卫旭东

冷冻切片技术已广泛应用于临床多年，要求病理医师在患者手术中快速准确的出具病理结果，为临床医师下一步治疗提供依据，如明确甲状腺病变良恶性，决定是否进行根治性治疗；甲状腺微小乳头状癌前哨淋巴结是否转移，决定是否清扫淋巴结。但由于诊断时间短、观察受限、病变不典型等因素，部分病例难以在手术中获得明确病理诊断，需等待术后石蜡切片的免疫组化染色来明确，增加患者二次手术的风险。直接免疫组化染色法在冷冻切片上直接进行，可在手术中协助判断病变良恶性。本实验探讨基于冷冻切片的直接免疫组化染色法在甲状腺乳头状癌中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2020年7～9月甘肃省人民医院、甘肃省肿瘤医院术中送检的新鲜甲状腺乳头状癌标本30例(经典亚型22例、滤泡亚型8例)，肿块直径0.2～3 cm，13例送检了前哨淋巴结，10例发生淋巴结转移。男性13例，女性17例，年龄24～57岁，平均45岁。另收集30例良性甲状腺病变组织(结节性增生17例、滤泡性腺瘤6例、淋巴细胞性甲状腺炎7例)作为对照，所有标本均行冷冻切片及石蜡切片的病理诊断。

1.2 仪器与试剂德国Leica CM1950冷冻切片机；OCT组织包埋剂；苏木精染液；1%盐酸乙醇分化液；2%碳酸锂返蓝溶液；0.5%伊红染液，梯度乙醇；二甲苯透明液；树胶封片剂；直接免疫组化试剂盒及抗体Galectin-3(克隆号R105)、CK19(克隆号R1002)，购自贵州美鑫达医疗科技公司。石蜡切片免疫组化染色采用EnVision两步法；Roche BenchMark XT免疫组化染色机染色；抗体Galectin-3(克隆号9c4)、CK19(克隆号MX054)购自福州迈新公司。

1.3 方法术中肿瘤切除送至病理科，肉眼观察后，病变部位取材，冷冻切片，参数为：箱体温度-30 ℃，冷冻头温度-30 ℃，5 μm厚切片。组织样本头加冷冻包埋剂OCT，放组织标本，切片染色流程及时间见表1。冷冻组织病理报告发出后，冷冻剩余组织流水解冻，除去包埋剂，10%中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋。Roche BenchMark XT染色机行石蜡切片免疫组化染色。

1.4 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直接免疫组化染色与石蜡切片免疫组化染色时间对比分析直接免疫组化染色中，病变组织采用85%甲醇、10%甲醛、5%冰醋酸固定1 min，封闭，滴加一抗，显色。流程约15 min。石蜡切片免疫组化采用Roche BenchMark XT染色机进行，耗时280 min(表1)。两组相比，冷冻切片直接免疫组化染色大幅缩短了时间。

表1 两种免疫组化染色法流程及时间对比分析

2.2 直接免疫组化染色与石蜡切片免疫组化染色质量对比分析直接免疫组化染色中，CK19、Galectin-3在甲状腺乳头状癌中呈弥漫、连续的细胞胞质阳性(图1、2)，在少部分病例的癌巢中呈斑驳的不均匀着色。甲状腺良性病变中仅个别病例呈微弱阳性着色。甲状腺前哨淋巴结转移癌中CK19(图3)、Galectin-3呈弥漫强阳性，可发现微小转移癌。石蜡切片免疫组化法采用Roche BenchMark XT机染色，细胞质着色，染色鲜艳，细胞形态清晰，稳定、可靠，质量佳，两种染色方法相比，染色质量一致。

①A①B①C②A②B②C③

2.3 直接免疫组化染色与石蜡切片免疫组化染色结果对比分析直接免疫组化染色法中，CK19、Galectin-3在甲状腺良性病变中的阳性率为6.67%(2/30)、10%(3/30)，在甲状腺乳头状癌中的阳性率为96.67%(29/30)、93.33%(28/30)，两组相比差异有统计学意义(表2)。冷冻剩余甲状腺乳头状癌组织行石蜡切片免疫组化法染色，Galectin-3、CK19的阳性率为96.67%(29/30)、96.67%(29/30)，与直接免疫组化染色法近似，差异无统计学意义(表3)。

表2 甲状腺乳头状癌及甲状腺良性病变中CK19、Galectin-3的表达

表3 甲状腺乳头状癌组织的两种免疫组化染色法结果对比分析

2.4 甲状腺前哨淋巴结转移癌的诊断准确性评析10例甲状腺前哨淋巴结转移癌组织，冷冻切片的HE染色正确诊断6例(60.00%)，冷冻切片+直接免疫组化染色正确诊断10例(100%)，以术后病理诊断为金标准，冷冻切片的直接免疫组化法准确性优于单纯HE染色，两组相比差异有统计学意义(表4)。

表4 直接免疫组化染色法与单纯HE染色诊断甲状腺前哨淋巴结转移癌正确率对比分析

3 讨论

基于HE染色的形态学诊断有一定的局限性，存在漏诊、误诊可能，如甲状腺乳头状癌与乳头状增生，滤泡性腺瘤与滤泡亚型乳头状癌形态学改变类似，鉴别诊断困难，病理医师有时会出具描述性报告或延迟报告，等常规病理检查结果确诊[1-2]，增加了患者二次手术的风险。

免疫组化染色应用抗原、抗体结合的原理，通过化学反应使特异性蛋白显色，以明确组织细胞的起源及性质。传统免疫组化染色基于石蜡包埋组织，不包括组织脱水、包埋、切片时间(约12 h)，仅单纯免疫组化染色就需280 min才能完成，无法满足术中快速病理诊断(<30 min)的要求。本实验采用基于冷冻切片的直接免疫组化染色法，与传统的EnVision两步法相比，无需添加二抗，省去了反应步骤，节约时间；且冷冻切片组织固定时间短，分子内或分子间的醛键尚未形成，抗原决定簇不会封闭，无需组织修复，节约时间，可以满足术中快速冷冻切片对时间的要求。

研究显示Galectin-3、CK19等抗体在甲状腺乳头状癌中高表达，在良性病变中表达缺失，可作为诊断甲状腺乳头状癌的特异性标志物[3]。本实验应用直接免疫组化法染色，发现Galectin-3、CK19在甲状腺乳头状癌中的阳性率显著高于甲状腺良性病变组织，说明两种抗体联合检测可在手术中区分甲状腺乳头状癌和其他良性病变。基于冷冻切片的直接免疫组化与传统免疫组化染色相比，两种抗体的阳性率基本一致，两种染色方法的阳性率差异无统计学意义，说明直接免疫组化染色与传统免疫组化染色的敏感性和特异性相当，在甲状腺乳头状癌诊断中具有较好的应用价值。如遇不典型病变，可适当增加抗体种类，如Cycnlin D1、MC、BRAF V600E、Ki-67等，增加术中冷冻切片诊断的准确性。此项技术简单、方便、易操作，亦可区分其他难以鉴别的肿瘤，沈元龙等[4]研究发现，冷冻切片的直接免疫组化染色较单纯的HE染色可显著提高硬化性肺泡细胞瘤和肺腺癌的诊断准确率。还可在术中快速准确的判断非小细胞肺癌纵隔淋巴结转移，使得Ⅰ期肺癌患者避免不必要的肺叶切除，缩少手术范围[5]。本组甲状腺前哨淋巴结转移癌组织CK19、Galectin-3呈弥漫阳性，可协助发现淋巴结转移灶，提高前哨淋巴结诊断准确率，优于单纯HE染色，降低了患者遭受二次手术或不必要的淋巴结清扫的风险。

本组实验的直接免疫组化染色质量稍差于传统染色，部分病例在癌巢中呈现斑驳的不均匀着色，可能有以下几种原因：(1)直接免疫组化为纯手工操作，标准化方面不及机染稳定。(2)封闭液、PBS冲洗后样本上的残留液体未能完全甩干，造成抗体、DAB显色液浓度被稀释，呈斑驳不均匀着色。有研究报道，将直接免疫组化染色与Leica Bond自动染色技术相结合，与手工染色相比，全自动染色具有更好的稳定性和较高的着色重现性[6]。随着全自动染色技术的成熟，该技术将具有更广阔的应用前景。

综上所述，基于冷冻切片的直接免疫组化染色法操作简单，制片时间短，染色结果稳定可靠，应用上述方法联合检测CK19、Galectin-3等甲状腺乳头状癌的诊断标志物，可显著提高手术中诊断的准确性，有助于发现前哨淋巴结的微小转移灶，具有重要的临床应用价值。