KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中的表达及与预后的相关性研究

朱文怡 李生君 候倩倩

白血病是一种血液系统的恶性肿瘤，老年白血病具有起病隐匿、初始症状不典型、伴有多种基础疾病等特点。老年白血病病人临床治疗时，容易发生感染或出血，骨髓抑制期相对较长，因此临床死亡率较高[1]。KIR2DL4基因是杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因家族中的功能型结构基因，其等位基因多态性水平丰富，且在老年白血病中的分布、检出率存在差异[2]。而KIR2DL4基因发挥作用依赖于相应配体的存在，KIR2DL4与非经典HLA-G分子配位[3]。有研究表明，急性髓系白血病及慢性淋巴细胞白血病病人细胞异常表达HLA-G分子，且伴有促凋亡基因HtrA2水平升高，其表达水平能反映白血病病人疾病严重程度，可指导临床治疗[4]。既往研究表明，白血病病人伴有促凋亡基因HtrA2表达水平异常，能加剧病情的发展[5]，但是二者具体关系尚未阐明。本研究探讨KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在白血病病人中的表达及与预后的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年7月至2018年1月老年白血病病人156例为观察组，其中男82例，女74例，年龄60～83岁，平均(75.39±4.51)岁；病程1～7个月，平均(3.59±0.56)个月。急性淋巴细胞白血病(ALL)67例，急性髓系白血病(AML)60例，慢性髓系白血病(CML)29例。选择同期健康体检的老年人79例为对照组，男40例，女39例，年龄60～84岁，平均(74.68±4.50)岁，2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：(1)符合老年白血病诊断标准[6]，且病人均经骨穿等检查确诊；(2)接受常规化疗等治疗，且病人均可耐受；(3)能完成KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2检测。排除标准：(1)合并精神异常、血液系统疾病、器质性疾病者；(2)合并认知功能障碍、自身免疫系统疾病或其他部位恶性肿瘤者。本研究获得医院伦理委员会批准，病人和(或)家属签署同意书。

1.3 方法

1.3.1 仪器与设备：RNA提取试剂、DL2000 DNA Marker、实时荧光PCR扩增仪(型号：480II，瑞士Liggter Cycer公司)、反转录试剂盒、SYBR实时荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物有限公司)；Mag Bind EZ Pure kit试剂盒(美国OMEGA Biltck公司)。

1.3.2 标本采集：观察组入院后次日取外周空腹静脉血5 mL，对照组体检当天取外周空腹静脉血5 mL，离心30 min，速度为3500 r/min，血清分离完毕后放置在-80℃冰箱中，备用。

1.3.3 KIR2DL4基因多态性检测：(1)DNA提取。取上述分离的血清标本，采用Mag Core提取试剂盒与Mag Core HF16 DNA纯化自动工作站完成DNA的提取，控制最终DNA浓度50～100 ng/μL。(2)基因分型测序。根据设计的引物对KIR2DL4基因引物序列完成编码(正向引物: 5′-TGGTGGGCCGCAGAACATGTGC-3′；反向引物: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′)，并对全部区域完成特异性PCR扩增。采用Mag Bind EZ Pure kit试剂盒完成磁珠纯化，并以PCR产物作为测序模板，完成正向、反向测序(采用NaOAc/EDTA、乙醇等进行纯化)。取最终获得的纯化测序产物，加入甲酰胺溶液13μL， 2 min变性，温度95℃，在ABI370 DNA测序仪上进行电泳，并将获得序列导入Assign4.7 SBT分析软件排查错误碱基，确定KIR2DL4基因多态性(包括2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011、9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4)[6]。

1.3.4 促凋亡基因HtrA2检测：(1)提取总RNA，反转录合成cDNA。取上述分离的血清标准，参考RNAison Plus说明书提取单个核细胞总RNA，取上述RNA提取液，完成琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上进一步确定RNA是否完整；紫外分光光度计进一步检测RNA(A260/A280控制在1.8～2.0)，控制RNA浓度为1～2 g/L，根据反转录说明书完成cDNA的合成。(2)检测方法。采用实时荧光定量PCR测定2组促凋亡基因HrA2 mRNA水平，引物设计见表1。设置PCR参数：30 ℃ 10min；42 ℃ 30 min；99 ℃ 5 min；5 ℃ 5 min，连续进行35个循环，72 ℃ 10 min延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，以β-actin为内对照。

表1 引物设计

2 结果

2.1 观察组与对照组KIR2DL4基因多态性比较 2组KIR2DL4基因多态性中2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011差异无统计学意义(P>0.05)；观察组9A型KIR2DL4高于对照组，10A型KIR2DL4低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 观察组与对照组KIR2DL4基因多态性比较(n)

2.2 观察组与对照组HtrA2 mRNA水平比较 观察组HtrA2 mRNA水平高于对照组(P<0.05)；观察组中不同疾病分型病人HtrA2 mRNA水平差异无统计学意义，见表3。

表3 观察组与对照组HtrA2 mRNA水平比较

2.3 KIR2DL4基因多态性及HtrA2 mRNA表达与老年白血病病人预后的关系 对老年白血病病人进行2年随访，随访期间死亡病人54例，死亡率为34.62%。死亡组与存活组2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008多态性差异无统计意义(P>0.05)；死亡组9A型KIR2DL4检出率、HtrA2 mRNA表达量均高于存活组(P<0.05)，10A型KIR2DL4检出率低于存活组(P<0.05)，见表4。

表4 存活组与死亡组各个基因多态性比较

2.4 老年白血病病人预后影响因素的Cox回归分析 将年龄、性别、疾病分型纳入Cox回归模型校正，对老年白血病病人预后因素进行分析，结果表明：老年白血病病人预后与2DL4-006、9A型KIR2DL4基因多态性、HtrA2 mRNA表达量均有关(P<0.05)，见表5。

表5 老年白血病病人预后影响Cox回归分析

3 讨论

KIR2DL4基因是一种结构基因，能与HLA-G配位，传递、抑制信号，亦可抑制NK细胞活性，是肿瘤细胞逃逸NK细胞免疫监控机制之一[7]。有研究结果表明：肥大细胞表面的抑制性KIR2DL4受体与HLA-G分子相互作用，能提高肿瘤细胞的侵袭性[8]。本研究中，观察组老年白血病病人2DL4-0011、9A型KIR2DL4低于对照组(P<0.05)； 10A型KIR2DL4高于对照组(P<0.05)，说明KIR2DL4基因在老年白血病病人中表达异常。通常来说，KIR2DL4基因配位的非经典HLA-G分子，除了在孕妇的滋养层细胞膜表面表达外，在其他正常细胞中表达较低或不表达。老年白血病病人9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4等位基因表达产物功能上存在明显的差异性，从而影响NK细胞对于白血病的杀伤、清除作用，导致老年白血病病人远期预后较差，死亡率相对较高[9]。

细胞凋亡是基因调控的一种主动死亡方式，亦是细胞有机调控机体发育、维持内环境的重要机制。本研究中，观察组HtrA2 mRNA水平高于对照组(P<0.05)，说明HtrA2 mRNA水平在老年白血病病人中表达异常。HtrA2 是近年来新发现的由细胞核编码的线粒体凋亡蛋白，主要存在于线粒体膜输尿管，部分可定位于细胞核[10]。陈泓磊等[11]研究表明，HtrA2 在乳腺癌、前列腺癌及胃癌中表达较低，但是在白血病病人中呈高表达，与本研究结果相符。进一步分析KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2与老年白血病病人预后的关系，结果表明：老年白血病病人死亡组与存活组KIR2DL4基因多态性中9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4和HtrA2 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。Cox回归分析结果表明：老年白血病病人预后与KIR2DL4基因多态性及HtrA2 mRNA水平有关，说明KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中存在异常，且与病人预后关系密切，测定KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2表达能评估病人预后，为病人治疗提供依据和参考[12]。