补阳还五汤含药血清对急性心肌梗死大鼠内皮祖细胞增殖、迁移和黏附能力的影响

温志浩，黄德庆，黄明剑，潘朝锌，王庆高，梁逸强，庞 延，曹亚平，李倩宇

（1. 广西中医药大学第一附属医院心血管内科，广西 南宁 530023；2. 广西中医药大学第一附属医院急诊科，广西 南宁530023；3. 广西中医药大学第一附属医院临床药理基地，广西 南宁 530023；4. 广西中医药大学，国家中医心血管病临床医学研究中心分中心，广西 南宁 530200）

急性心肌梗死（acute myocardial infaction，AMI）是一种严重的冠心病。在冠脉介入治疗得到广泛推广的今天，其死亡率已明显下降。药物洗脱支架通过抑制血管内膜增殖显著减少了支架内再狭窄的发生［1，2］。然而，由于药物洗脱支架对细胞增殖抑制作用是非选择性的，影响了支架植入后血管内皮细胞的修复，导致血管内膜愈合延迟，同时提高了晚期管腔丢失的风险［3，4］。因此，AMI 患者的远期预后仍不理想。

冠脉内皮损伤被认为是心血管疾病发生和发展的一个重要的始动环节［5］。随着AMI 治疗的后灌注时代的到来，采用何种方法促进AMI 后内皮修复，已经成为重要的临床和科研议题之一。既往许多研究表明，提高内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）数量和功能可促进受损冠脉内皮修复，促进血管的新生，改善心脏功能，但目前上述疗法仍停留在动物实验阶段，还缺乏可靠的临床研究，仍迫切需要探索新的治疗药物来改善EPCs 数量和功能。益气活血方药应用为AMI 治疗提供了新的研究方向。既往课题组纳入80 例符合气虚血瘀证的支架植入术后AMI 患者，随机分为治疗组与对照组。对照组采用西医常规处理，治疗组在对照组基础上加用补阳还五汤。结果显示，补阳还五汤联合西药较单纯使用西药，可更好地提高肱动脉内皮依赖血管舒张功能和血浆一氧化氮水平，并降低血浆内皮素-1 及神经肽Y。补阳还五汤联合西药可保护支架植入术后AMI 患者血管内皮功能［6］。但关于益气活血方药改善AMI 患者内皮功能的机制尚缺乏系统的研究。

为进一步探讨益气活血方药在改善EPCs 的数量和功能方面的作用，本研究采用补阳还五汤对AMI 大鼠进行干预，与阿托伐他汀钙对比，分离并培养EPCs，采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法、黏附能力测定实验以及改良的Boyden 小室的方法观察内皮祖细胞的增殖、黏附以及迁移能力，以期为益气活血方药保护AMI 患者血管内皮功能提供更多依据，从细胞水平研究该方药对EPCs 数量和功能的作用，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD 雄性大鼠（SPF 级）54 只，体重（230±20）g，6 周龄，提供方为南方医科大学动物中心，批号0016556，研究经广西中医药大学大学实验动物伦理委员会的批准。

1.2 药物、试剂及仪器

补阳还五汤配比：黄芪120 g、赤芍4.5 g、红花3 g、地龙3 g、川芎3 g、当归6 g、桃仁3 g。上述生药材去除杂质切制后，按组方剂量配比制作浸膏，使用前配蒸馏水，生药材终含量为2.0 g/mL。使用时采用补阳还五汤水煎液（12.83 g 生药/kg）灌胃进行治疗干预，每天1 次；对照药物阿托伐他汀，参考相关文献大鼠给药剂量设为10 mg·kg-1·d-1，每日1 次灌 胃［7］；M199 培 养 基（Gibco，11150067），CCK8（Dojindo，CK04），Dil-ac-LDL（索 莱 宝，H7970），FITC-UEA-I（Sigma，L9006）；生 物 倒 置 显 微 镜（OLYMPUS 公司，CKX41），细胞培养箱（Thermo Fisher 公司，HERAcell®150i）。

1.3 急性心肌梗死大鼠模型制备方法

取正常SD 大鼠，以3%戊巴比妥腹腔麻醉。将SD 大鼠四肢固定，气管插管，接呼吸机，于第3～4肋间心尖搏动区最强的点为中心，作横行切口，钝性分离肋间肌，将肺压向左侧胸腔，用弯镊轻轻撕开心包膜，从左心耳下方缝扎冠脉，结扎时力度要适中，注意防止将心肌离断。结扎后，以术后心电图标准肢体Ⅱ导联提示ST 段弓背抬高表明模型成功。逐层缝合关闭胸腔，待生命体征平稳可拔除气管插管，腹腔内注射青霉素预防感染。假手术组仅开胸，不结扎冠脉。

1.4 实验分组和给药

共分为6 组，每组9 只，于术后第2 天开始灌胃。（1）空白组：正常饮食，给予等量生理盐水灌胃；（2）假手术组：假手术后给予等量生理盐水灌胃；（3）模型组：造模后给予等量生理盐水灌胃；（4）西药对照组：造模后给予阿托伐他汀灌胃；（5）中药干预组：造模后给予补阳还五汤灌胃；（6）中西医结合组：造模术后给予补阳还五汤和阿托伐他汀钙灌胃。

1.5 EPC 提取

分别于术后7 、14 d 和第4 周观察相关指标，每次每组处死3 只大鼠进行EPCs 数量和功能的分析。

每组于各时间点随机取3 只大鼠，进行腹腔麻醉后固定。胸部消毒后，剪开胸部皮肤，穿刺心腔内抽血，肝素抗凝，摇匀后立即进行细胞分离。取大鼠淋巴细胞分离液Ls-1083 约4 mL 左右，按照血液：细胞分离液比5∶3，轻轻地加入血液于细胞分离液液面并离心（2 000 r/min，20 min）。离心完毕后，小心将中层细胞用吸入移至另一离心管。加入PBS 液轻轻吹打混匀后离心（1 500 rpm，10 min），吸去上层液体，上述同样方法吹打、混匀、离心两次。在加最后一次PBS 混匀后，在离心前吸少量用于细胞计数。细胞计数：在细胞计数板上滴入少量细胞混悬液，盖上盖玻片，显微镜下计数16 个小方格的细胞总数。将离心好的细胞上清吸去，根据细胞计数计算所需稀释的浓度决定需加M199 培养基的量。将单个核细胞按4×106/mL，铺在24 孔培养板（包被0.5%明胶）上，CO2培养箱培养4 d 后，以PBS洗掉非贴壁细胞，换M199 培养液继续培养至7 d。

1.6 EPCs 的鉴定与计数

每组EPCs 与acLDL-DiI（2.4 μg/mL），37 ℃孵育1 h，检测EPCs 对acLDL-DiI 的摄取情况。吸去acLDL-DiI，加2%多聚甲醛并固定细胞10 min。用PBS 液浸洗后将FITC-UEA-I（10 μg/mL）加于上述标本，37 ℃孵育l h。倒置荧光显微镜鉴定双染色阳性细胞为EPCs，用Image Pro Plus 图像分析软件进行细胞计数。计数5 个随机选择×200 视野的EPCs，取平均值。

1.7 对EPCs 增殖能力的影响

将各组EPCs 以等量空白EGM-2 配成单细胞悬液，接种于96孔板（每孔100 μL），各浓度分别设3个复孔，在CO2培养箱孵育48 h，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，孵育2 h 后检测OD 值。

1.8 对EPCs 迁移能力的影响

消化收集细胞后计数。25 μL 培养液稀释血管内皮生长因子，终浓度为50 ng/mL，加入改良的Boyden chamber 的下室，盖上滤膜，再盖上趋化小室的上室。将含2×104EPCs 的50 μL 培养液注入上室，盖载玻片。在CO2培养箱培养24 h。刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定3～5 min，以结晶紫染色5 min，蒸馏水冲洗。后置于显微镜下，观察迁移到低层的细胞，随机选择3 个视野（×200）计数。

1.9 对EPCs 黏附能力的影响

在EPCs 中加入含0.25%胰蛋白酶，消化2～3 min，反复吹打瓶壁细胞后，收集于离心管中，离心3～5 min（800～1 000 r/min），弃上清，加培养液并计数。取同等数目的EPCs，铺于包被纤维连接蛋白的培养板上，孵育30 min 并计数。

1.10 统计学处理

结果采用SPSS 21.0 统计软件处理，实验数据用均数±标准（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析或秩和检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCs 的培养、鉴定及计数结果

原代培养第3 天，可见细胞集落形成，单个核细胞呈半悬浮生长，边缘细胞呈纺锤型生长；第4 天可见大量梭形细胞由集落中央向外周生长；第5 天见梭形细胞由集落中央向外周生长，呈放射状；显微镜观察呈DIL-ac-LDL 和FITC-UEA -I 双荧光染色阳性认为是正在分化的EPCs。可见在第7 天、第14天及第4 周外周血EPCs 计数中，模型组较假手术组明显下降，中药干预组、西药对照组及中西医结合组较模型组均显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），中西医结合组较中药干预组及西药对照组对EPCs 计数的提升作用更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1 和图1。

表1 各组EPCs 计数的比较（n=3，±s）Tab 1 EPCs count of each group（n=3，±s）

表1 各组EPCs 计数的比较（n=3，±s）Tab 1 EPCs count of each group（n=3，±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05；与中药干预组相比，□P＜0.05；与西药对照组相比，▲P＜0.05。

4 w 97.500±0.451△□▲97.400±0.917 87.200±0.700*91.800±0.954*△95.600±0.603*△▲99.100±0.651*△□▲组别空白组假手术组模型组西药对照组中药干预组中西药结合组7 d 91.000±0.833△□▲91.800±0.351 77.500±1.401*83.100±0.666*△87.600±0.751*△▲92.500±0.608△□▲14 d 96.500±0.586△94.400±1.358 85.000±3.350*90.300±2.178△93.600±2.914△95.400±1.650△▲

图1 光镜下各组原代EPCs（200×）Fig 1 Light microscopy of primary EPCs of each group（200×）

2.2 对EPCs 增殖能力的影响

模型组在3 个时间点的增殖能力均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组及各用药组随着时间的推移，其增殖能力呈现先下降后上升的趋势，而西药对照组、中药干预组、中西医结合组在3个时间点较模型组均可显著改善EPCs 的增殖能力（P＜0.05）。在7 d 和14 d 时间点，中药干预组与西药对照组改善作用类似，而中西医结合组改善作用更好，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组EPCs 增殖能力（n=5，±s）Tab 2 Proliferation capacity of EPCs of each group（n=5，±s）

表2 各组EPCs 增殖能力（n=5，±s）Tab 2 Proliferation capacity of EPCs of each group（n=5，±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05；与中药干预组相比，□P＜0.05；与西药对照组相比，▲P＜0.05。

4 w 0.837±0.033 0.824±0.044 0.619±0.053*1.052±0.052 △1.018±0.055 △1.069±0.027 △组别空白组假手术组模型组西药对照组中药干预组中西药结合组7 d 0.609±0.043 0.624±0.049 0.423±0.050*0.829±0.023 △0.846±0.025 △1.053±0.046 △□▲14 d 0.430±0.031 0.422±0.039 0.238±0.034*0.622±0.051 △0.620±0.044△0.813±0.045△□▲

2.3 对EPCs 迁移能力的影响

模型组在第7～14 天内的迁移能力呈显著下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组及各用药组随着时间的推移，其迁移能力逐渐上升。而与模型组比较，西药对照组、中药干预组、中西医结合组在3 个时间点均可显著改善EPCs 的迁移能力。在7 d 及14 d 时间点，中药干预组与西药对照组改善作用类似，而中西医结合组的迁移功能改善作用更好，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组EPCs 迁移能力的比较（×104，n=3，±s）Tab 3 Migration capability of EPCs of each group（×104，n=3，±s）

表3 各组EPCs 迁移能力的比较（×104，n=3，±s）Tab 3 Migration capability of EPCs of each group（×104，n=3，±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05；与中药干预组相比，□P＜0.05；与西药对照组相比，▲P＜0.05。

4 w 1.117±0.066 1.182±0.048 0.610±0.027*1.436±0.111△1.451±0.049△1.844±0.055△□▲组别空白组假手术组模型组西药对照组中药干预组中西药结合组7 d 0.668±0.055 0.686±0.031 0.310±0.011*1.033±0.099△1.028±0.066△1.838±0.102△□▲14 d 0.203±0.016 0.203±0.008 0.091±0.013*0.618±0.009△0.694±0.009△1.166±0.082△□▲

2.4 对EPCs 黏附能力的影响

模型组在第7～14 天内的黏附能力呈显著下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），而西药对照组、中药干预组、中西医结合组在3 个时间点较模型组均可显著改善EPCs 的黏附能力。在第7 天、第14 天及第4 周时间点，中药干预组与西药对照组改善作用类似，而中西医结合组较另两个用药组可更好的提高EPCs 黏附能力，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组EPCs 黏附能力的比较（×105，n=3，±s）Tab 4 Adhesion capacity of EPCs of each group（×105，n=3，±s）

表4 各组EPCs 黏附能力的比较（×105，n=3，±s）Tab 4 Adhesion capacity of EPCs of each group（×105，n=3，±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05；与中药干预组相比，□P＜0.05；与西药对照组相比，▲P＜0.05。

4w 0.795±0.011 0.786±0.020 0.650±0.010*0.790±0.007△0.790±0.007△0.902±0.017△□▲组别空白组假手术组模型组西药对照组中药干预组中西药结合组7 d 0.724±0.014 0.731±0.006 0.548±0.029*0.702±0.007△0.693±0.014△0.753±0.027△□▲14 d 0.563±0.011 0.570±0.003 0.369±0.014*0.494±0.009△0.476±0.008△0.561±0.018△□▲

3 讨论

近年来，随着糖尿病、血脂代谢异常等危险因素的流行，AMI 在我国的发病率呈逐渐升高的态势。中国心血管病研究报告2018 指出，2013 年中国大陆年龄≥15 岁人口冠心病的患病人数已达约1 139.6 万人，较2008 年增加超过100 万人。自2005年，AMI 死亡率呈现快速上升趋势，近期农村和城市AMI 死亡率分别为74.72/10 万和58.69/10 万［8］。而根据霍勇教授在2019 年代表国家心血管疾病医疗质量控制中心发布的2018 年中国大陆地区冠心病介入治疗数据，2018 年全年中国冠心病介入例数为915 256 例，已接近百万例，但仍未降低AMI 患者死亡率。

在快速恢复AMI 患者血供基础上，如能有效防范支架内管腔丢失，患者的心功能将得到更好的保护，其远期预后亦可得到更好的改善。研究表明EPCs 可以向缺血心肌趋化黏附，帮助修复损伤的冠脉内皮，加速受损冠脉内皮化修复，帮助保持心脏功能，降低AMI 患者死亡率［9，10］。EPCs 在血管内皮损伤修复过程中发挥着非常重要的作用。动员入血的EPCs 在一些黏附趋化因子作用下可向损伤局部迅速迁移，通过整合［11］、融合［12］以及旁分泌［13］的方式促进新生冠脉血管生成，并帮助内皮修复。

据报道，冠心病患者EPCs 数量较正常人降低40%，其数量与危险分层级别呈负相关，EPCs 数量的降低和活性的抑制与冠脉粥样硬化的发展明显相关［14，15］。本研究结果也显示，在第7、14 天及第4周急性心肌梗死模型大鼠外周血EPCs 计数、增殖、迁移及黏附能力均较假手术组均显著下降，而中药干预组、西药对照组及中西医结合组外周血EPCs计数、增殖、迁移及黏附能力较模型组均显著增加（P＜0.05），而中西医结合组较中药干预组及西药对照组对EPCs 功能的改善作用更为显著（P＜0.05）。

冠状动脉粥样硬化可以造成内皮的损伤。内皮化修复类似于一种创伤后的愈合过程，中医药对于创伤的修复有着非常丰富的理论和实践经验。中医认为创伤修复不利的重要病机之一是气行无力，血行不畅。气虚血瘀则创面愈合不良，应用内托结合活血之法促进创面修复愈合，而且益气活血法则被公认是AMI 治疗中核心治疗方法之一［16，17］。很多实验和临床研究证明，益气活血法对改善内皮功能障碍具有一定优势。李亥辰等［18］研究发现，麝香保心丸可帮助改善心绞痛患者冠脉内皮功能，降低心绞痛发作频率，缩短其发作时间。谢生梅等［19］研究发现，复方丹参滴丸联合西药治疗可改善冠心病患者内皮功能、血脂和血液黏度。本研究结果显示，他汀类药物联合补阳还五汤较单纯的中药或西药治疗可更好地改善AMI 大鼠的内皮功能，可能可以更好改善AMI 患者内皮功能，从而降低AMI 患者死亡率。本研究仅检测了EPCs 功能的变化，但引起EPCs 功能改变的具体机制尚未进行深入探讨，后续可增加相关的机制研究以提高实验的可信度。

作者贡献度说明：

温志浩：实验设计和论文撰写；黄德庆：实验实施动物饲养与取材；黄明剑：实验实施EPCs 原代细胞提取与培养；潘朝锌：实验实施EPCs 原代细胞鉴定与计数；王庆高：实验实施EPCs 增殖与迁移功能；梁逸强：实验实施EPCs 黏附功能；庞延：数据分析；曹亚平：数据与图像分析；李倩宇：数据与图像分析。