基于网络药理学探讨逍遥丸治疗抑郁和焦虑的作用机制

刘 琳，邹俊波，张小飞，王 媚，郭东艳，周 晓，王 林，张 雪，史亚军

（陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046）

近些年，人们的生活和工作以及学习压力不断增加，使得抑郁症和焦虑症患病率也大幅度提升。据统计，全世界患有抑郁症的人数占3.01%～5.00%，患有焦虑症占4.00%～6.50%［1］。在我国18岁以上的成年人当中，23.4% 的人有抑郁症状，4.6%的人患有抑郁症［2］，4.98%的人患有焦虑，其中大学生和就业人群甚为严重。目前，治疗抑郁和焦虑的药物主要是以西药为主，如艾司西酞普兰、文拉法辛、苯二氮卓类等药物。但其副作用大、依赖性强、用药周期长，给患者身体带来了一定的伤害。

逍遥丸收录于宋代的《太平惠民和剂局方》，由柴胡、薄荷、当归、芍药、茯苓、白术以及生姜、甘草组成。具有疏健脾、养血调经、肝气不舒等功效，临床上应用于妇女乳腺增生、经前期综合征、月经失调、多囊卵巢综合征、围绝经期综合征、慢性肝炎肠易激综合征、神经功能紊乱综合征以及焦虑和抑郁症等多种疾病［3，4］。尤其在妇科疾病的应用极为广泛，被称为“女科圣药”。同时它作为疏肝法的代表方，近些年来在治疗焦虑症和抑郁症中效果也颇为显著。但中药复方具有“多成分、多靶点”的特点，使得逍遥丸治疗抑郁症和焦虑症的作用机制尚未得到很好的阐明。

网络药理学是将药物作用网络与生物网络相结合，分析药物与该网络中特定节点或模块之间的相互作用，从而了解药物与机体相互作用的科学。基于“多基因-多靶点-复合疾病”模型，系统地探讨了药物与疾病之间的关系［5，6］。将网络药理学与中药复方相结合，可以解释中药的作用机理，找到中药的有效物质。本研究运用网络药理学研究逍遥丸治疗抑郁和焦虑的机制，为抑郁症和焦虑症的防治提供新思路，为临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药材成分靶点

利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）对逍遥丸中八味药材：柴胡、薄荷、当归、芍药、茯苓、白术、生姜、甘草分别进行化学成分搜集。根据ADME 参数设置口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18 为筛选条件，获得具有较高活性的化合物成分以及靶点。

1.2 疾病靶点收集

分 别 以“anxiety”、“depressive disorder”为 关 键检索词在Malacards 和Genecards 两个数据库查找与其相关的基因靶点。Genecards 数据库首页输入检索词后分别以Score≥9.00、Score≥25.00 为筛选条件找到相对应的疾病靶点。

1.3 “药材成分-靶点-疾病”网络构建

根据上述预测与筛选结果，删除没有对应靶点的成分以及重复的靶点。利用Venny 2.1.0 找到与疾病的共同靶点。创建“药材成分-靶点”、“疾病-靶点”关系文件以及属性文件，导入到Cytoscap（3.2.1）构建“药材成分-靶点-疾病”网络图。

1.4 蛋白-蛋白互作（PPI）网络构建

将疾病与药材的共同靶点输入String 中的“multiple proteins”，选择“Homo sapiens”检索。下载蛋白相互作用的tsv 文件，将其导入Cytoscape 根据节点自由度选择筛选重要靶点。

1.5 生物通路富集分析

在R 软件平台安装cluster profiler 软件包，对重要靶点进行GO 和kegg 功能富集分析，将结果以条形图和气泡图形式输出。再使用R 平台的top GO软件包构建交互网络。

2 结果

2.1 成分靶点收集结果

通过TCMSP 数据库共收集了161 种化合物，其中柴胡17 种、当归2 种、白芍13 种、茯苓15 种、白术7 种、生姜5 种、甘草82 种、薄荷20 种。八味药材总共含有247 个靶点（不包括重复靶点）。

2.2 疾病靶点的筛选结果

Malacards 数据库中找到关于焦虑症的靶点8个、抑郁症靶点4 个。Genecards 数据库中以Score≥9.00 找到关于焦虑症的靶点有337 个，Score≥25.00 的找到关于抑郁症的靶点有379 个。将两个数据库找到的靶点去除重复靶点后焦虑症的相关靶点有337 个，抑郁症的相关靶点有379 个。分别将药材成分靶点和疾病靶点输入Venny 2.1.0 作图后，发现疾病与药材共同靶点有24 个，焦虑症和抑郁症的共同靶点有150 个，见图1。

图1 逍遥丸与疾病之间共同靶点图Fig 1 Common targets between Xiaoyao Wan and diseases

2.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将24 个共同靶点上传至String 数据库，组织（organism）设置为“Homo sapiens”得到蛋白与蛋白之间相互作用的图，如图2。然后下载PPI tsv 文件将其导入Cytoscape，再将疾病-靶点、药材-靶点导入Cytoscape 中作出“逍遥丸-靶点-疾病”网络图，如图3 所示。利用Network Analyer 计算出网络中节点“betweenness centrality”、“closeness centrality”、“degree”后，在NetworkAnalye 中 的Visualize Parameters 选择“Degree”得到图4。图中颜色越深节点越大表示相关性越强、越重要。度值由高到低为钠依赖性去甲肾上腺素转运体（APP）、D（2）多巴胺受体（DRD2）、钠依赖型5-羟色胺转运体（SLC6A 4）、白 细 胞 介 素-6（IL-6）、MU 型 阿 片 受 体（OPRM1）、过氧化氢酶（CAT）、胺氧化酶［含黄素］A（MAOA）、5-羟色胺受体2A（HTR2A）、单胺氧化酶B（MAOB）、白细胞介素-1β（IL-1β）、5-羟色胺受体3A（HTR3A）、大麻素受体1（CNR1）、钠依赖型多巴胺转运蛋白（SLC6A3）、D（2）多巴胺受体（DRD1）、雌激素受体（ESR1）、白细胞介素-10（IL-10）、雌激素受体（ESR1）、C-反应蛋白（CRP）、超氧化物歧化酶［Cu-Zn］（SOD1）、去甲肾上腺素转运蛋白基因（SLC6A2）、γ-氨基丁酸受体亚单位α-2（GABRA2）、血清对氧磷酶/芳香酯酶1（PON1）、γ-氨基丁酸受体亚单位α-1（GABRA1）、神经元型乙酰胆碱受体亚单位α-7（CHRNA7）。

图2 String 中24 个蛋白之间相互关系图Fig 2 The relationship diagram of 24 proteins in String

图3 “逍遥丸-靶点-疾病”网络图Fig 3 The network diagram of“Xiaoyao Wan-targetsdiseases”

图4 靶点与靶点相互关系图Fig 4 The relationship map between targets

2.4 功能富集分析

为了解逍遥丸在治疗抑郁和焦虑中发挥作用的机制，本文通过R 语言的cluster profiler 软件包执行GO 和KEGG，共富集并排列了1 231 条路径，其中KEGG 有72 条路径，表1 显示了前10 条路径。图5 的气泡图是根据P值大小排列的，P值越小表示该路径与疾病的相关性越强。可以看出神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羟色胺能突触（serotonergic synapse）、可卡因成瘾（cocaine addiction）、多巴胺能突触（dopaminergic synapse）、酒精中毒（alcoholism）、苯丙胺成瘾（amphetamine addiction）、吗啡成瘾（morphine addiction）、朊病毒病（prion diseases）、非洲锥虫病（African trypanosomiasis）、尼古丁成瘾（Nicotine addiction）等参与抑郁和焦虑的病理发展。通过图6 和表2 可以了解到这些路径上的靶点如DRD2、DRD1、HTR2A、MAOB、MAOA、SLC6A3 是同时作用于许多不同的路径。通过cluster profiler 包重建了围棋交互网络，此网络反映这些围棋术语之间的内部关系，根据图7 可以看出圆点颜色越红形状越大代表此路径与该病理发展越明显。

图5 KEGG 前20 条P 值显著的通路富集气泡图Fig 5 Enrichment of the first 20 pathways of KEGG pathway

图6 抑郁、焦虑、逍遥丸靶点的KEGG 相互作用网络图Fig 6 KEGG interaction network diagram of depression，anxiety and Xiaoyao Wan targets

图7 核心靶点调控途径网络图Fig 7 Network diagram of core targes regulation pathway

表1 KEGG 通路富集前10 条路径Tab 1 Enrichment of the first 10 pathways of KEGG pathway

表2 数字所代表的靶点Tab 2 Targets represented by number

GO 分析结果表示，在“生物过程（BP）”中富集1 024 条路径，根据矫正后的P值进行排序得到柱形图，见图8。由图可以看出，逍遥丸治疗抑郁和焦虑的靶点主要参与对有毒物质的反应（response to toxic substance）、神经递质水平的调节（regulation of neurotransmitter levels）等过程的调节。GO 分析在“细胞成分（CC）”中富集了54 条路径，P值最显著的前20 项如图9，从细胞组分的富集结果来说主要参与了突触后膜（postsynaptic membrane）、突触前（presynapse）、突触前膜积分成分突触前膜（presynapse）等部位。GO 分析结果在“分子功能（MF）”中富集了81 条路径，图10 列出了前20 条。从分子功能富集结果可以看出，逍遥丸治疗抑郁和焦虑主要体现在神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）、铵离子结合（ammonium ion binding）、无机阳离子转运蛋白活性（inorganic cation transmembrane transporter activity）、阳离子转运蛋白活性（cation transmembrane transporter activity）等方面。

图8 “生物过程（BP）”前20 条P 值显著的通路富集图Fig 8 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "biological process（BP）"

图9 “细胞成分（CC）”前20 条P 值显著的通路富集图Fig 9 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "cellular component（CC）"

图10 “分子功能（MF）”前20 条P 值显著的通路富集图Fig 10 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "molecular function（MF）"

3 讨论

抑郁和焦虑被认为是常见的、不易治愈、发病率逐年增高的精神类疾病，致病因素较为复杂，其发病机制尚不明确。中医研究认为，抑郁和焦虑是由于情志不舒、气机郁滞、肝疏泄失常所引起的，隶属于情志病、心病的范畴。现代研究对抑郁症和焦虑症发病机制主要是从神经递质假说，神经内分泌功能紊乱假说以及免疫功能紊乱假说等方面进行解释。

逍遥丸治疗疾病达八十多种，涉及妇科、内科、消化科、儿科以及皮肤科，在临床上广为应用。现代研究发现逍遥丸具有调节内分泌系统、神经系统、免疫系统、保肝利胆、改善微循环、改善胃肠道功能性等作用。近几年在神经系统方面应用居多，主要应用于抑郁症和焦虑症。

本研究通过网络药理学借助多种生物信息学数据库及Cytoscape 软件等构建了逍遥丸治疗抑郁症和焦虑症的“成分-靶点”网络以及蛋白-蛋白互作，并对关键节点以及通路进行了分析。通过以上的研究与分析，发现逍遥丸化合物成分主要集中在5-羟色胺能突触、多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、对神经递质水平的调节、APP、DRD2、SLC6A4、IL-6、CAT、HTR2A、IL-1β、HTR3A、SLC6A3、DRD1、IL-10、SLC6A2、GABRA2、GABRA1 等通路或靶点。

5-羟色胺能突触与5-HT 密切相关，中枢神经系统5-HT 的含量及功能异常会导致抑郁、焦虑、精神分裂等精神类疾病。有研究发现，焦虑模型小鼠大脑中缝背核的5-HT 能神经元的活性明显增加，将5-HT1A 受体激动剂注射到海马和杏仁核后发现会起到抗焦虑作用［7，8］。Hendricks 等［9］将与5-HT 能系统发育相关转录因子Pet-1 敲除后，小鼠中枢5-HT 能神经元缺失、海马等脑区5-HT 含量显著减少，Pet-1-/-小鼠的焦虑水平显著高于野生型小鼠。突触后5-HT1AR 与5-HT 结合会激活5-HT 的分泌，加强细胞信号通路的转导从而改善抑郁症状［10］。在应激反应中，5-HT2A 受体表达升高会增进动物焦虑和抑郁样行为，当其下调后症状明显减轻［11，12］。多巴胺能突触参与脑内多巴胺（DA）的合成，DA 在愉快感觉的产生、传递以及愉快信息的存储过程中发挥着重要作用。相应膜受体激活是DA发挥作用的关键，DA 受体具有5 种亚型可分成DRD1 和DRD2 两类。吴帅等［13］研究证明多巴胺抗抑郁作用是通过DRD1 抑制谷氨酸及其NMDA 受体NR2B 亚基因表达来实现。DRD2 激活后也可导致抑郁的发生，当DRD2 被激活后，细胞内cAMP 水平降低，在产后抑郁初期，它的表达明显升高不但抑制cAMP 的产生而且也影响DA 生成，进而导致抑郁症加重［14］。神经活性配体-受体相互作用信号通路的受体含4 类可分为A 类（视紫红质样）、B 类（分泌素样）、C 类（亲代谢性谷氨酸盐/外激素）和离子通道/其他受体，当出现焦虑时会导致A 类受体表达下调［15］。IL-6、IL-1B、IL-10 属于炎症细胞因子，具有调节免疫系统、参与机体的信号传递作用。申永辉等［16］发现抑郁症患者经SSRI 类药物治疗后，血清中炎症细胞因子水平明显下降，抑郁症状得到改善。GABRA2、GABRA1 是γ-氨基丁酸的受体，而γ-氨基丁酸是哺乳动物脑内广泛分布的抑制性神经递质，与受体结合参与调节多种神经元活性［17，18］。研究发现，GABRA2、GABRA1 参与了抑郁发病机制［19］。APP 是去甲肾上腺素转运体（NET）的一种，NET 被认为是去甲肾上腺素再摄取抑制剂（NRI）抗抑郁作用的靶点。许多常用抗抑郁药物作为NET 的高亲和力底物可抑制NET 对突触间隙NE 的重摄取［20］。小鼠的去甲肾上腺素基因（SLC6A2）敲除后使得去甲肾上腺素转运体缺乏，可能导致抗应激行为［21，22］，有研究表明，SLC6A3、SLC6A2、DRD2 等基因的交互作用可能在中国汉族人群发生抑郁中起重要作用［23］。

通过在TCMSP 中的筛选发现逍遥丸中含有柴胡皂苷、芍药苷、beta-谷甾醇、茯苓酸、槲皮素、白术内酯以及豆甾醇等化学成分。柴胡皂苷A 可调节炎症因子及相关通路，提高神经营养因子含量，改善5-HT、DA 水平，下调下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能发挥抗抑郁和焦虑的作用［24，25］。芍药苷是一种双向抗炎免疫调节药，可降低慢性束缚应激肝郁脾虚证焦虑模型大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α，对改 善 焦 虑 和 抑 郁 有 一 定 作 用［26，27］。Beta-谷 甾 醇 是一种常见的植物甾醇，具有良好的抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等药理活性［28］。茯苓酸具有抗炎作用，通过减弱白细胞与微血管内皮细胞间的黏附，抑制肠黏膜微血管内皮细胞的过量分泌，阻止过多白细胞到达炎症部位和过度炎症反应［29］。槲皮素属于黄酮类化合物，具有神经保护作用。白术内酯通过抑制NLRP3 炎性体的激活来从而减少IL-1β的产生，在慢性不可预测温和应激（CUMS）诱导的小鼠抑郁模型中发挥抗抑郁样作用［30］。豆甾醇能明显减少氯胺酮引起的小鼠的自发活动、刻板行为、强化降压延迟等一些精神病症状，增加γ-氨基丁酸（GABA）、减少多巴胺、并且能显著降低结肠组织炎性因子［31］。

综上所述，本文发现逍遥丸可能通过柴胡皂苷、芍药苷、白术内酯、茯苓酸等化学成分作用于5-羟色胺能突触、多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用等相关通路。推测逍遥丸通过神经递质影响5-HT、DA、参与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）以及干预炎症反应过程起到治疗抑郁和焦虑作用。此外，对于上述讨论中剩余通路与靶点的相关研究报道较少，可为今后深入研究抗抑郁与焦虑作用潜在靶点的分子机制研究提供线索。