N-乙酰半胱氨酸对佐剂性关节炎大鼠治疗作用及机制

杨 珺，潘献柱，汪晓庆，谢琳琳，刘梅梅，赵大海，叶 静，汪陶荣，陈晓宇

（1. 安徽医学高等专科学校形态学实验中心，安徽 合肥 230061；2. 安徽医科大学第二附属医院呼吸内科，安徽 合肥 230601；3.安徽医科大学形态学实验中心，安徽 合肥 230032）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）病因未明，常表现为多发性小关节对称性炎症，往往以体液免疫为主，病变部位有大量炎细胞浸润，病变迁延会导致患者关节功能障碍、残疾［1］。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）是高度保守的模式识别受体因子（pattern recognition receptor factors，PRRs）家族中的跨膜受体，激活后能进行炎症反应［2］。Toll 样 受 体2（Toll-like receptor 2，TLR2）是重要的TLRs，通过识别细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），介导体液免疫反应，募集下游炎症细胞因子转录，导致肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白 细 胞 介 素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、白细胞介素-10（interleukin 10，IL-10）等致炎细胞因子升高，引起机体自身免疫性炎症［3］。同时，长期慢性炎症使得RA 患者活动期机体活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）升高，抗氧化物酶水平下降［4］。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是含有巯基的半胱氨酸衍生物，可降解酸性肽链中的二硫键［5］。炎症反应和氧化应激相互作用可能为RA 发病的重要机制［6］，但两者关联性需进一步确认。NAC 的抗氧化作用，清除机体ROS，能否降低RA 的慢性炎症反应，值得进一步研究。佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）是常用RA 动物模型［7］，本文旨在研究NAC 对AA大鼠的抗炎作用，并观察TLR2 和下游炎症因子途径在其中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

足跖容积测量仪（YLS-7C 型），北京凯辉盛达科技发展有限公司；激光共聚焦显微镜（LEXT OLS4100 型），日本奥林巴斯公司；全自动酶标仪（infnite 200 PRO），瑞士帝肯公司。NAC，美国Swanson 公司；弗氏完全佐剂（freund's complete adjuvant，FCA），武汉易泰科技有限公司；兔抗鼠TLR2 单克隆抗体，荷兰Hycult Biotech 公司；兔抗鼠β-actin 多克隆抗体，美国Abbkine 公司；ELISA 试剂盒TNF-α、IL-1β、IL-10，美国Biovision 公司；羊抗兔二抗和显色试剂盒，武汉博士德生物有限公司；蛋白测定和化学发光试剂盒，美国Absin Bioscience有限公司。

1.2 动物分组与给药

50 只健康雄性sprague-dawley（SD）大鼠，体质量（210±10）g，购于安徽省动物实验中心（皖准字2019-01）。SD 大鼠饲养于（25±2）℃环境中，白天夜晚12 h 光照交替。造模和给药参照文献［8］，50只动物随机分成两组：对照组10 只0.1 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）注射右后足趾皮下；另40 只造模，构建AA 大鼠，右后足趾皮下注射0.1 mL FCA，致炎10 d 后，再分成4 组，每组10只：模型组及NAC 低、中、高剂量组（灌胃给药量50、100、200 mg/kg），NAC 连续灌胃16 d，对照组与模型组灌胃等量PBS。本实验符合学校实验动物伦理委员会规定。

1.3 关节炎症状判定和标本处理

关节炎症指标参照文献［8］，造模后10 d 开始，每4 天记录一次关节病变。（1）关节肿胀度：反映继发性炎症改变，应用容积测量仪测量SD 大鼠左后肢踝关节以下的容积变化（ΔmL）=致炎后左后肢容积（mL）-致炎前左后肢容积（第10 天，mL）。（2）关节炎指数：反映四肢炎性改变，最高12 分，标准如下，0 分：四肢关节结构无变化；1 分：某个四肢关节出现红斑或轻微肿胀；2 分：≥2 个四肢关节出现红斑和轻微肿胀；3 分：≥2 个四肢关节出现红斑和肿胀；4 分：≥2 个四肢关节肿胀明显，不能站立。第26天，戊巴比妥钠麻醉下，股静脉取血、离心，-20 ℃保存待测炎症因子；每组随机选取3 只SD 大鼠左后肢踝关节，做组织学检查；每组余下7 只SD 大鼠踝关节滑膜组织，以踝关节为中心，逐层切开，剥取关节面上方呈淡黄色的滑膜组织，-80 ℃冻存作进一步研究。

1.4 踝关节免疫组织化学检查

做组织学检查的SD 大鼠踝关节固定于4%多聚甲醛溶液中，硝酸脱钙、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、厚3 μm 切片，免疫组化采取链霉素过氧化合物酶复合物（strept actividin-biotin complex，SABC）法，根据试剂盒说明书，切片脱蜡至水，经过3%H2O2处理、抗原修复、封闭抗原，滴加一抗兔抗鼠TLR2 单克隆抗体（浓度1∶200）50 μL，4 ℃孵育过夜，次日二抗、SABC 染液50 μL、DAB 显色、苏木精复染，再行脱水、透明、封片、镜检、摄片。免疫组化染色判断，阳性结果为细胞质（或核）呈黄色或棕黄色，采用PBS 替代一抗作阴性对照。采用南京捷达JD801 图像分析软件，参照文献［9］计算TLR2 免疫反应阳性细胞光密度值（optical density，OD）。

1.5 Western blot 法测定TLR2 蛋白表达

取出踝关节滑膜组织后，加入组织裂解液，将滑膜组织研磨成匀浆，离心后，测定组织总蛋白含量。上样30 μg 蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电转移法将蛋白至硝酸纤维素膜，孵育一抗：兔抗鼠TLR2 单克隆抗体（浓度1∶1 500），兔抗鼠β-actin 多克隆抗体（浓度1∶3 000），化学发光法显像，Image J 软件作半定量分析。

1.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）测定血清炎症因子浓度

SD 大鼠血清炎症因子含量检测采取ELISA法，按照美国Biovision 公司提供的ELISA 试剂盒说明书步骤，检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10 浓度。

1.7 统计学处理

采用SPSS23.0 统计学分析软件包，关节炎指数、关节肿胀度、TLR2 蛋白和炎症因子含量等计量资料以（±s）表示，进行方差齐性检验后采用t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NAC 对AA 大鼠继发性关节肿胀的影响

为观察NAC 改善SD 大鼠非炎症侧关节肿胀情况，应用排水法计算从FCA 注射第10 天开始，连续16 d。与对照组SD 大鼠比较，AA 模型组继发性足肿胀明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）；NAC低、中、高剂量组灌胃给药后，明显抑制AA 模型大鼠的继发性足肿胀（P＜0.05 或P＜0.01），NAC 高剂量组变化最明显，见表1。

表1 各组足肿胀度（ΔmL）比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of secondary lateral joint swelling（ΔmL）of rats in the each group（n=10，±s）

表1 各组足肿胀度（ΔmL）比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of secondary lateral joint swelling（ΔmL）of rats in the each group（n=10，±s）

注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

26 d 0.23±0.03 0.82±0.07##0.73±0.08*0.54±0.04**0.44±0.05**组别对照组模型组NAC 低剂量组NAC 中剂量组NAC 高剂量组10 d 0.10±0.02 0.43±0.05##0.44±0.04 0.44±0.04 0.45±0.03 14 d 0.12±0.03 0.54±0.05##0.51±0.04 0.49±0.04*0.47±0.05*18 d 0.17±0.02 0.71±0.05##0.64±0.06*0.54±0.04**0.48±0.05**22 d 0.20±0.03 0.88±0.06##0.81±0.06*0.71±0.05**0.54±0.04**

2.2 NAC 对大鼠关节炎指数症的影响

致炎10 d 后，与对照组SD 大鼠相比较，AA 模型组大鼠非致炎侧（左后肢）足趾开始肿胀，进行性加重，直至站立困难，各时间点关节炎指数评分明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；NAC 低、中、高剂量组各治疗组均有效缓解症状，关节炎指数评分降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），以NAC 高剂量组最为明显，见表2。

表2 各组继发性关节炎指数比较（n=10，±s）Tab 2 Comparison of secondary arthritis index of rats in each group（n=10，±s）

表2 各组继发性关节炎指数比较（n=10，±s）Tab 2 Comparison of secondary arthritis index of rats in each group（n=10，±s）

注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

26 d 0.95±0.40 8.71±0.61##5.56±0.46**4.23±0.47**3.72±0.37**组别对照组模型组NAC 低剂量组NAC 中剂量组NAC 高剂量组10 d 0.56±0.25 5.91±0.45##5.71±0.39 5.61±0.42 5.82±0.39 14 d 0.76±0.29 6.80±0.63##6.12±0.56*5.97±0.65*5.58±0.47**18 d 0.92±0.27 8.60±0.68##6.39±0.71**6.19±0.68**5.74±0.52**22 d 0.98±0.31 9.52±0.72##6.87±0.68**5.43±0.52**5.06±0.48**

2.3 免疫组化染色显示NAC 对AA 大鼠踝关节TLR2 蛋白表达

阳性染色呈黄色或棕黄色颗粒，位于关节滑膜和软骨细胞中。对照组SD 大鼠踝关节滑膜组织中有少量TLR2 蛋白阳性表达；AA 模型大鼠踝关节滑膜组织增厚，TLR2 蛋白表达增加；NAC 治疗组随着灌胃剂量的增加，TLR2 蛋白阳性表达逐渐减弱，见图1。计算TLR2 蛋白阳性OD 值，与对照组OD 值（0.13±0.02）比较，AA 模型组OD 值（0.39±0.09）明显升高（t=6.733，P＜0.01），NAC 低、中、高剂量组TLR2 蛋白的OD 值均降低，分别为（0.31±0.07）、（0.26±0.06）、（0.21±0.05），与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。

图1 各组踝关节TLR2 蛋白表达免疫组化结果（SABC 染色×100）Fig 1 Immunohistochemical results of TLR2 protein expression in ankle joints of rats（SABC staining ×100）

2.4 Western blot 检测NAC 对关节滑膜组织中TLR2 蛋白的表达影响

与对照组SD 大鼠关节滑膜组织比较，TLR2 蛋白在模型组滑膜组织中表达增加明显，而NAC 低、中、高剂量组滑膜组织中TLR2 蛋白含量较对照组升高，但较模型组明显下降。经统计学分析，NAC低、中、高剂量组较模型组滑膜组织TLR2 蛋白降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3 及图2。

图2 各组滑膜组织TLR2 蛋白表达Fig 2 TLR2 protein expression in synovial tissues of rats in eac h group

表3 各组TLR2/β-actin 相对蛋白量表达（n=7，±s）Tab 3 Relative protein content（TLR2/β-actin）in each group（n=7，±s）

表3 各组TLR2/β-actin 相对蛋白量表达（n=7，±s）Tab 3 Relative protein content（TLR2/β-actin）in each group（n=7，±s）

注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

相对蛋白量0.21±0.03 0.67±0.04##0.56±0.07*0.38±0.05**0.32±0.03**组别对照组模型组NAC 低剂量组NAC 中剂量组NAC 高剂量组

2.5 ELISA 测定大鼠血清炎症因子含量

与对照组比较，模型组血清中致炎因子TNF-α、IL-1β 相比较含量明显增加，而IL-10 含量明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；而NAC各 剂 量 组 致 炎 因 子TNF-α、IL-1β 含 量 下 降，而IL-10 含量明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见表4。

表4 各组血清炎症因子比较（pg/mL，n=10，±s）Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group（pg/mL，n=10，±s）

表4 各组血清炎症因子比较（pg/mL，n=10，±s）Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group（pg/mL，n=10，±s）

注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

IL-10 12.03±0.54 7.62±0.55##8.16±0.45*8.49±0.79*9.36±0.63**组别对照组模型组NAC 低剂量组NAC 中剂量组NAC 高剂量组TNF-a 470.57±27.94 830.32±65.04##759.94±63.07*742.50±71.11*605.87±56.03**IL-1β 12.15±1.50 34.98±3.13##30.59±3.73*24.35±2.81**20.13±2.34**

3 讨论

RA 以破坏多发性小关节的软骨组织和骨结构的自身免疫病，当患者机体在病痛、促炎因子、持续的关节滑膜炎症等伤害性刺激下，组织细胞中氧自由基过度生成，使得机体氧化-抗氧化作用失调，机体过度的ROS 加重炎症反应，使得RA 病程进展［9］。TNF-α、IL-1β 的过表 达会破坏关节滑膜和关节软骨，引起骨侵蚀加重，骨修复系统长期遭受破坏，引起关节畸形，程度不等的关节强直和功能丧失。弗氏完全佐剂建立的AA 动物模型是研究RA 的常见动脉模型，本研究通过大鼠皮下注射弗氏完全佐剂，应用关节肿胀度、关节炎指数，反映四肢炎性改变，结果证实造模成功。氧化应激在AA 大鼠关节损伤中作用明显，由致炎因子导致机体氧化应激是关节病变的重要原因［10］。本研究ELISA 检测显示，模型组血清中致炎因子TNF-α、IL-1β 较对照组明显增加，而抑炎因子IL-10 含量明显降低，说明AA大鼠炎症的存在和损伤。

NAC 为还原性谷胱甘肽的前体，可促进细胞谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，增加血清中内谷胱甘肽GSH 含量，清除ROS，从而实现多途径抗生物氧化作用，NAC 是机体ROS 抑制剂，通过促进还原型谷胱甘肽（GSH）生物合成，清除ROS 而抗氧化和抗炎功能［11］。本研究也证实，NAC 能剂量依赖性地改善AA 大鼠的关节炎指数和关节肿胀度，降低模型动物血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β 表达，升高抑炎细胞因子IL-10 表达，表明NAC 对AA大鼠抗氧化的同时，可有效降低炎症损伤。

RA 的发病机制未明，持续性的滑膜炎是骨破坏重要因素，研究RA 发病过程中炎症信号通路是认识该病的重要方向［12］。TLR 和下游炎症因子信号转导通路是免疫性炎症的重要信号通路，TLR 过表达有可能在RA 发病中影响较大［13］。有研究发现在低氧和细菌脂多糖刺激下的大鼠睾丸炎模型中，在炎症起始阶段TLR2 活化后，可促进炎症细胞黏附与侵袭睾丸生精细胞，导致精子生成障碍［14］。本研究通过免疫组化染色和蛋白免疫印迹均证实，相对于正常对照大鼠，AA 大鼠模型滑膜组织呈TLR2蛋白高表达，表明异常激活的TLR2 蛋白参与AA大鼠发病进程中；而且，NAC 治疗组滑膜组织中TLR2 蛋白表达水平较模型组明显降低，且呈NAC浓度依赖趋势，即随着NAC 浓度升高，AA 大鼠关节滑膜组织中TLR2 蛋白渐减弱，表明NAC 可能通过抑制TLR2 的活性而对AA 大鼠起到一定治疗作用。TLR2 下游效应细胞因子产生于单核-巨噬细胞系统和关节成纤维样滑膜细胞等，与炎症疾病活动度有一定的相关性［15］。本研究表明，低剂量的NAC 即可明显降低大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α 降低，升高抑炎因子IL-10，但NAC 是否通过降低TLR2 活性，从而降低炎症反应有待进一步机制研究。

作者贡献度说明：

杨珺：实验的进行及实验数据的统计分析、文章撰写；潘献柱、汪晓庆：免疫组化实验；谢琳琳、刘梅梅：AA 造模及实验数据的采集；赵大海、汪陶荣：实验数据的统计分析；叶静：实验设计和文章审校；陈晓宇：实验统筹安排及文章审校。