依达拉奉对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织Caspase-3和HIF-1α表达的影响

王转转，阴怀清2，师 睿

缺氧缺血性脑病(HIE)是一种新生儿常见的脑损伤疾病，死亡率高，易长期致残如智力低下、脑瘫、癫痫发作和学习障碍[1]，严重者造成极大的家庭、社会负担，临床上对该病缺乏有效的治疗。依达拉奉在神经系统疾病中发挥重要作用，被认为是治疗脑梗死等缺血性疾病有效的药物，但依达拉奉是否可应用于治疗新生儿HIE尚少见报道。因此，本实验通过建立缺氧缺血性脑损伤模型，观察依达拉奉干预后脑组织中神经细胞凋亡半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的变化，探讨依达拉奉脑保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与分组 由山西医科大学实验中心提供7日龄SD新生大鼠108只，雌雄不限，平均体质量15 g。随机分为A组、B组、C组，每组36只。各组再根据处死时间6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d分为6个亚组，每个亚组6只。

1.2 试剂与药品的配制 一抗(兔抗鼠HIF-1α、Caspase-3)和二抗(即用型SABC试剂盒)及原位末端标记法(TUNEL)细胞凋亡试剂盒(购自武汉博士德生物技术有限公司)。规格5 mL/10 mg的依达拉奉注射液，用生理盐水(体积比1∶4)稀释为0.3 mg/L。

1.3 缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型制备与干预方法 参照Rice等[2]方法制备HIBD模型。A组为假手术组，动物只切开颈部皮肤并游离出左颈总动脉后直接缝合皮肤，不进行结扎和缺氧处理；B组为HIBD模型组；C组在HIBD模型的基础上给予腹腔注射依达拉奉4 mg/kg，间隔24 h给药1次，直至处死。造模后各组动物放入饲养笼中母乳喂养至相应时间。

1.4 标本留取 各组分别于造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d处死，断头取脑，10%甲醛室温固定24 h后留取视交叉中点前后4～5 mm的脑组织，脱水，石蜡包埋，形成实验所需组织。

1.5 苏木精-伊红(HE)染色、免疫组织化学法及TUNEL检测 石蜡包埋，冠状位切片，行HE染色，观察细胞形态及结构变化；免疫组化法检测Caspase-3和HIF-1α的表达；TUNEL法检测神经细胞凋亡。Caspase-3阳性染色信号定位于细胞质，染色为棕黄色颗粒，HIF-1α阳性染色信号定位于细胞核和(或)细胞质，染色呈棕黄色颗粒。

1.6 图像采集及数据收集 应用美国Aperio公司Scansaope数字病理扫描系统，经计算机扫描、取图，统计出阳性细胞数/高倍视野(×400)，取平均值。计数大脑皮层凋亡细胞，计算凋亡率(%)，即凋亡指数(AI)，取平均值。

2 结 果

2.1 神经行为改变情况 A组新生大鼠无异常神经行为变化，B组造模后全部发生不同程度的行为异常改变，主要表现为：躁动不安，活动增加，头部和躯体的持续颤抖；后逐渐由兴奋转为抑制，活动明显减少，出现嗜睡，少数出现惊厥。C组异常表现不如B组明显。

2.2 脑组织病理变化 A组各个时间点脑组织解剖层次清晰，神经细胞排列整齐，形态正常，核深染，核仁清楚，无神经细胞缺失；B组、C组均见大脑组织神经细胞变少、变形，结构混乱，细胞核缩小、溶解、破碎，符合凋亡的形态改变；但与C组同一时刻相比，B组的变化更为明显。详见图1。

图1 各组大鼠大脑皮层脑组织病理图(×400)

2.3 大脑皮层HIF-1α的表达情况 免疫组织化学染色结果显示，脑组织HIF-1α阳性细胞主要分布于大脑皮层及海马，胞核或胞浆呈棕黄色。HIF-1α的表达在A组各时间点基本维持在一个水平；在缺氧6 h开始增强，12 h达高峰，后逐渐下降。C组各时间点HIF-1α的表达水平较B组均明显下降，但高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

表1 各组HIF-1α在不同时间点的阳性细胞数表达比较(±s) 单位：个

图2 各组大鼠脑组织大脑皮层不同时间点HIF-1α表达情况(DAB×400)

2.4 大脑皮层Caspase-3的表达情况 免疫组织化学染色结果显示，脑组织Caspase-3阳性细胞主要分布于大脑皮层及海马，胞浆呈棕黄色。Csapase-3的表达在A组各时间点大致维持在一个水平。C组各时间点Caspase-3的表达水平较B组均明显下降，仍高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图3。

表2 各组Caspase-3在不同时间点的阳性细胞数表达比较(±s) 单位：个

图3 各组大鼠脑组织大脑皮层不同时间点Caspase-3表达情况(×400)

2.5 大脑皮层凋亡细胞的表达情况 A组大脑皮层偶见或无凋亡细胞，B组6 h后可见神经细胞凋亡，之后逐渐增加，5 d达到峰值，C组各时间大脑皮层凋亡神经细胞较B组少，但仍高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图4。

表3 各组不同时间点大脑皮层神经细胞凋亡指数比较(±s) 单位：%

图4 各组大鼠脑组织大脑皮层不同时间点神经细胞凋亡情况(×400)

3 讨 论

依达拉奉是一种自由基清除剂，具有亲脂基团和高血脑屏障通透性，在保护运动神经元免受氧化应激介导的神经变性中起着潜在的作用。它能抑制脑自由基引发的延迟神经元死亡[3]，减轻磷脂膜中多不饱和脂肪酸氧化所致的神经元凋亡[4]，并通过减少血管内皮细胞的损伤从而减轻缺血性脑膜疾病引起的神经元损伤[5]。 各种动物模型研究表明，依达拉奉具有神经保护作用[6]，依达拉奉能保护神经干细胞免受辐射诱导引起的细胞凋亡，并能通过抑制脑损伤中的相关有害分子来治疗脑梗死[7]。 Zhang等[8]研究表明，依达拉奉可以改善急性脑梗死病人的神经功能障碍。此外，它对各种神经系统疾病也有影响。

HIF是一种转录因子，在调节细胞对缺氧的反应方面似乎很重要。HIF-1活性取决于HIF-1α的表达水平。在常氧条件下，HIF-1α表达保持在较低水平，但缺氧显著诱导其表达。HIF-1α诱导各种转录程序，其中包括低氧条件下的多能性因子。 在缺氧缺血期间HIF-1α在神经元中的作用存在争议，认为同时具有促进死亡和抗凋亡的双重作用。 有研究显示，通过使用来自成年小鼠HIF-1α敲除的脑细胞，发现HIF-1α主要促进急性低氧环境中的凋亡；相反，HIF-1α在新生大鼠中度缺氧再灌注脑卒中模型具有神经保护作用[9]。有研究显示，HIF-1α通过影响促凋亡因子表达，参与新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的进程，抑制自身表达，减少神经细胞凋亡，减轻脑损伤[10]。在HIE的发病过程中，凋亡是迟发性神经损伤的主要死亡形式。细胞凋亡是一系列导致Caspase激活和细胞解体的程序性事件，其中Caspase-3在细胞凋亡的信号转导通路中处于核心位置[11]。有研究表明，脑缺血时HIF-1α不仅能通过调节Bcl-2/Bax 来抑制Caspase-3，还能通过血管内皮生长因子(VEGF)机制、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通路及ERK信号通路来调控Caspase-3的活性，从而抑制Caspase级联放大反应，最终减少神经细胞损伤[12-13]。

本实验发现对照组Caspase-3与HIF-1α不表达或者仅有少量表达，HIBD后Caspase-3与HIF-1α明显增加，推断Caspase-3与HIF-1α参与了缺氧缺血脑损伤的发生；建立新生大鼠HIBD模型并给予依达拉奉干预，显示依达拉奉治疗组各时间点脑组织Caspase-3与HIF-1α表达水平较HIBD组均明显降低，且凋亡细胞明显减少，此外，治疗组各时间点脑组织病理变化较HIBD组轻，说明依达拉奉在一定程度上通过抑制脑组织中Caspase-3与HIF-1α的表达而发挥神经保护作用。