SMC4在人食管癌组织中的表达及对食管癌细胞增殖、侵袭和转移的作用机制研究

张 冉 石长林 苟小军 何鸿晏（四川省巴中市中心医院胸心外科，巴中636000）

食管癌（esophageal cancer，EC）作为全球范围致命的恶性肿瘤，主要分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）［1］。其中，ESCC是亚洲中部和东部最常见病理学类型，占所有病理学类型的90%。全球癌症统计数据显示，ESCC全球发病率持续升高，已成为严重公共卫生问题［2］。EC转移和复发是预后差的主要原因之一，而EC细胞侵袭和迁移是促进EC转移的关键［3］。因此，探究EC细胞侵袭迁移的作用机制对其后续治疗具有重要意义。染色体结构维持蛋白4（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）是SMC核心成员，在有丝分裂过程染色体凝集和分离过程中起重要作用［4］。SMC4可参与各种非有丝分裂染色体功能发挥过程，如DNA修复、维持基因下调状态［5］；SMC4在前列腺癌、结直肠癌及肝癌中呈异常高表达［6-8］，且与癌细胞侵袭迁移密切相关，而SMC4与EC的关系鲜有报道。本研究检测SMC4在人EC组织中的表达，分析其与临床病理学参数的关系，通过小分子干扰RNA（siRNA）特异性降低SMC4表达，观察其对EC细胞侵袭和迁移的影响，进一步探讨其可能的分子机制，为EC临床治疗提供新靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人EC组织标本及细胞来源 收集2018年5月至2019年4月我院手术切除的EC组织标本及其相应癌旁正常组织标本各114例，其中女性64例、男性50例，平均年龄（52.51±3.72）岁；＜50岁41例，≥50岁73例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期64例；病理组织学类型：鳞癌84例，腺癌30例；组织分化程度：低分化65例，中分化28例，高分化21例；淋巴结转移74例，未转移40例；肿瘤直径：≥3 cm 79例，＜3 cm 35例；浸润深度：未及浆膜层34例，突破浆膜层80例。入选标准：癌组织经病理学证实为EC且未合并其他肿瘤；癌旁组织距离肿瘤边缘外2 cm以上且经病理学证实未发生癌变；患者术前未接受放化疗及其他治疗。制备组织石蜡切片备用。EC细胞株KYSE170和Eca-109购自中科院上海细胞研究所。

1.1.2 主要试剂SMC4即用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司；胰蛋白酶、RPIM1640细胞培养基购自美国Gibco公司；qRT-PCR检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自广东锐博生物科技技术股份有限公司；反转录试剂盒购自 美 国Sigma；KYSE170-siNC、KYSE170-siSMC4、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4由上海吉玛制药技术有限公司合成；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；青、链霉素购自华北制药有限公司；总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体采购自英国Abcam公司。

1.1.3 主要仪器 细胞培养箱采购自上海三腾仪器有限公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo公司；细胞培养箱购自SANYO；生物安全柜购自Haier；高速离心机购自Thermo；Ti-U∕Ti-s倒置荧光显微镜购自Nikon。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色检测组织切片中SMC4表达 将收集的EC组织及其相应癌旁正常组织样本固定包埋并切片，常规脱蜡和水化后置于柠檬酸盐缓冲液中高压修复，3%H2O2室温下浸泡以阻断内源性过氧化物酶，封闭，加入稀释后的SMC4一抗4℃孵育过夜，次日复温后PBS洗涤，加入稀释后的HRP标记的驴抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室温孵育30 min，PBS洗涤。加入适量DAB孵育5 min，去离子水终止反应，苏木素复染，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡透明后干燥，中性树胶封片，镜检观察并记录实验结果。结果判定标准：由2位经验丰富的病理医师对病理切片进行盲评，各切片随机选取5个高倍视野，各视野随机计数200个细胞，以细胞出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，根据染色强度及阳性细胞率综合评分。染色强度记分依据：无着色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。阳性细胞数记分：无阳性细胞记为0分，＜25%记为1分，25%～50%记为2分，51%～75%记为3分，＞75%记为4分。以上2项计分相加结果≥3分为阳性。

1.2.2 稳定干扰SMC4细胞系建立 对数生长期EC细胞株KYSE170、Eca-109分别消化后加入含10%胎牛血清的高糖培养基，均匀铺至6孔板，37℃、5%CO2培养，待细胞融合至70%左右时换为无血清培养基待转染，按照Lipofectamine2000转染试剂说明书操作，分别将干扰质粒KYSE170-siSMC4及阴性对照KYSE170-siNC转染至KYSE170细胞，将Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4转染至Eca-109细胞，继续培养48 h，将构建成功的稳定干扰细胞系分别记为KYSE170-siSMC4和KYSE170-siNC，Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4，同时设置KYSE170和Eca-109空白对照组。

1.2.3 MTT检测KYSE170和Eca-109细胞增殖 消化KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4细胞，调整细胞浓度，5×103个∕孔接种至96孔板，混匀，37℃、5%CO2培养，第2、3、4、5、6天分别加入MTT试剂20 μl，37℃避光孵育4 h，弃孔内液体，加入100 μl DMSO，37℃摇床快速振荡15 min，充分溶解结晶物，酶标仪检测490 nm处OD值，实验重复3次，取平均值。

1.2.4 Transwell小室检测KYSE170和Eca-109细胞侵袭KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4细胞消化后，调整细胞浓度，5×103个∕小室分别加入Transwell小室上室，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，常规培养48 h，棉签擦净上室细胞，PBS清洗，结晶紫染色，常规制片，倒置显微镜下观察并拍照，随机观察5个视野，记录穿膜细胞数，实验重复3次。

1.2.5 划痕实验检测KYSE170和Eca-109细胞迁移KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4细胞消化后，调整细胞密度为5×105个∕ml，取2 ml接种于6孔板，并在6孔板背面划5条平行线，24 h后用200 μl枪头在细胞中划2条垂直于背面平行线的直线，PBS冲洗2次，加入2 ml无胎牛血清RPMI1640培养液，于0、24 h在倒置显微镜下观察细胞向划痕中间迁移的距离并拍照，各组实验设3个平行孔，实验重复3次。

1.2.6 IFA检测上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关分子N-cadherin表达KYSE170、KYSE170-siSMC4及阴性对照KYSE170-siNC细胞消化后，5×105个∕ml均匀铺至6孔板，37℃、5%CO2静置培养24 h，弃培养液，4%多聚甲醛固定10 min，PBS冲 洗2遍，0.1%Triton100通 透15 min，PBS冲洗，5%BSA室温封闭30 min，分别加入适量封闭液稀释的N-cadherin一抗，室温孵育2 h，PBS冲洗，加入稀释后的荧光标记的山羊抗兔IgG，37℃避光孵育1 h，PBS冲洗，稀释好的DAPI染细胞核，干燥，封片，共聚焦显微镜下观察拍照，记录阳性细胞数。

1.2.7 Western blot检测KYSE170细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达 收集各组细胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定含量。制备蛋白样品，配制SDSPAGE凝胶，电泳，转膜，5%BSA封闭液室温孵育2 h。分别加入适量封闭液稀释的一抗，4℃孵育过夜，次日复温，PBST洗涤，加入适量稀释好的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育2 h，PBST洗涤，ECL避光5 min，暗室曝光并拍照，以GAPDH为内参。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立t检验，计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Graphpad5.01软件作图，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SMC4在EC组织和癌旁正常组织中的表达SMC4在EC组织中的阳性表达率（83.33%）高于显著癌旁组织（10.53%，P＜0.001）。

2.2 SMC4在EC不同临床病理分组中的表达SMC4表达与肿瘤直径、TNM临床分期、浸润程度、淋巴结转移及组织分化程度密切相关（P＜0.05），与EC患者年龄、性别无关（P＞0.05，表1）。

表1 SMC4在EC不同临床病理分组中的表达（例）Tab.1 Expression of SMC4 in different clinicopathologi⁃cal groups of esophageal cancer（n）

2.3 稳定下调SMC4表达细胞系构建Western blot结果显示，KYSE170-siSMC4组SMC4表达明显低 于Control组 和KYSE170-siNC组（P＜0.05，图1A），Eca-109-siSMC4组SMC4表达明显低于Control组和Eca-109-siNC组（P＜0.05，图1B），提示SMC4下调细胞株构建成功。

图1 Western blot检测KYSE170和Eca-109细 胞 中SMC4表达Fig.1 Western blot detection of SMC4 expression in KYSE170 and Eca-109 cells

2.4 SMC4对KYSE170和Eca-109细胞 增殖的 影响MTT结果显示，与Control组和KYSE170-siNC组相比，KYSE170-siSMC4组第4、5、6天增殖能力明显下降（P＜0.05，图2A），Eca-109-siSMC4组第4、5、6天增殖能力明显低于Control组和Eca-109-siNC组（P＜0.05，图2B）。提示下调SMC4表达可明显抑制KYSE170和Eca-109细胞增殖。

2.5 SMC4对KYSE170和Eca-109细 胞侵袭 的影响KYSE170-siSMC4组穿膜细胞数显著少于Control组和KYSE170-siNC组（P＜0.05，图3A），Eca-109-siSMC4组穿膜细胞数明显少于Control组和Eca-109-siNC组（P＜0.05，图3B），提示下调SMC4表达可明显抑制KYSE170和Eca-109细胞侵袭。

图3 SMC4对KYSE170和Eca-109细 胞 迁 移 的 影 响（×200）Fig.3 Effect of SMC4 on cell migration of KYSE170 and Eca-109 cells（×200）

2.6 SMC4对KYSE170和Eca-109细胞 迁移的 影响KYSE170-siSMC4组细胞迁移能力减弱，创伤愈合速率减慢，覆盖划痕区域少于Control组和KYSE170-siNC组（P＜0.05，图4A），Eca-109-siSMC4组覆盖划痕区域明显少于Control组和Eca-109-siNC组（P＜0.05，图4B）。提示下调SMC4表达可抑制细胞迁移。

图4 SMC4对KYSE170和Eca-109细胞迁移的影响Fig.4 Effect of SMC4 on cell migration of KYSE170 and Eca-109 cells

2.7 SMC4对EMT相关分子N-cadherin表达的影响 共聚焦显微镜观察发现，下调SMC4表达，与Control组和KY SE170-siNC相比，KYSE170-siSMC4细胞中N-cadherin表达明显下降（P＜0.05）。提示SMC4可促进N-cadherin表达（图5）。

图5 SMC4对EMT相关分子N-cadherin表达的影响（×100）Fig.5 Effect of SMC4 on expression of EMT related mole⁃cule N-cadherin（×100）

2.8 SMC4对细胞PI3K∕Akt信号通路关键蛋白表达的影响KYSE170-siSMC4组p-PI3K和p-Akt表达 明 显 低 于Control组 和KYSE170-siNC组（P＜0.05），3组PI3K和Akt表达差异无统计学意义（P＞0.05，图6）。

图6 SMC4对KYSE170细胞PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达的影响Fig.6 Effect of SMC4 on expressions of key proteins of PI3K/Akt signaling pathway in KYSE170 cells

3 讨论

EC是全球高发恶性肿瘤之一，我国EC发病率位居全球第五，死亡率位居第四，且呈不断上升趋势［9］。分子靶向治疗是继手术治疗、放化疗的肿瘤治疗策略，可增强肿瘤抑制基因表达，抑制肿瘤细胞增殖和转移，已成为国内外肿瘤研究领域热点。EC是常见消化道肿瘤，包括鳞癌与腺癌2种，近年虽然EC治疗取得了一定进展，但EC患者生存率并未显著提高［10］。EC细胞侵袭和迁移是其转移的关键，也是影响其疗效和预后的主要原因［11］。因此，深入研究EC侵袭迁移的机制，有望为EC治疗提供新靶点，对其治疗具有重要意义。肿瘤转移是复杂的生物学过程，涉及黏附分子、蛋白溶酶、细胞因子和生长因子及相关信号通路等，机制复杂［12-13］。目前对肿瘤转移的认识有限，现已发现的转移相关分子不足以解释转移的各层面，分子机制尚未明确。表观遗传学为人EC转移研究提供了新的思路，也为阻止和治疗EC转移提供了新方案。

SMC4作为染色体腺苷三磷酸酶中SMC家族重要成员，是维持细胞周期中S期正常进展的关键蛋白。近期研究发现，SMC4在肝癌组织中异常高表达，且与血管侵犯密切相关［14］。上调SMC4表达可通过转化生长因子β（TGF-β）∕Smad信号通路促进胶质瘤增殖侵袭，因此SMC4在肿瘤发生发展过程中起重要作用［15］。本研究采用IFA法检测SMC4在EC组织和癌旁正常组织中的表达，结果显示SMC4在EC组织中的阳性表达率为83.33%，在癌旁组织中的阳性表达率为10.53%，SMC4在EC组织中的阳性表达率高于癌旁组织（P＜0.001）。进一步分析SMC4表达与EC临床病理学参数的关系，结果显示SMC4蛋白表达与EC患者年龄、性别无关，而与肿瘤直径、TNM临床分期、浸润程度、淋巴结转移及组织分化程度密切相关（P＜0.05）。为进一步探讨SMC4对EC侵袭、迁移的影响，本研究采用细胞转染技术构建了SMC4下调细胞株，MTT结果显示，与Control组 和KYSE170-siNC组 相 比，KYSE170-siSMC4组细胞在第4、5、6天增殖能力明显下降（P＜0.05），Eca-109-siSMC4组第4、5、6天增殖能力明显低于Control组和Eca-109-siNC组（P＜0.05）。提示下调SMC4表达可明显抑制KYSE170和Eca-109细胞增殖。采用Transwell和划线法检测细胞侵袭迁移能力，结果显示，KYSE170-siSMC4组细胞侵袭和迁移能力显著低于Control组和KYSE170-siNC组（P＜0.05），Eca-109-siSMC4组细胞侵袭和迁移能力显著低于Control组和Eca-109-siNC组（P＜0.05），提示下调SMC4表达可抑制EC细胞KYSE170和Eca-109增殖、侵袭和转移。

EMT是具有上皮形态和功能的细胞表现出间质细胞样特征的生理和病理学过程，常因极性和细胞间连接消失、细胞骨架重排而形成［16］。EMT是胃癌、结直肠癌、肺癌及乳腺癌等多种实体肿瘤侵袭及转移的重要进程，其原因为EMT是肿瘤细胞从肿瘤母体脱离并向周围组织侵袭及远处转移的起点，可减弱肿瘤细胞间黏附力，增强其生存及侵入间质的能力［17］。细胞黏附分子钙黏蛋白家族成员中的神经性钙黏蛋白（N-cadherin）常被作为间质样细胞的标志物，且被证实在多种肿瘤EMT进程中表达升高［18］。本研究经IFA及共聚焦显微镜观察发现，下调SMC4表 达 的EC细胞KYSE170中N-cadherin表达显著下降，说明SMC4可促进N-cadherin表达，即可促进EC细胞EMT进程。

PI3K∕AKT在肿瘤增殖、侵袭和迁移过程中起重要作用，激活的PI3K可使质膜产生3-磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而PIP3可与Akt结合促使其从细胞质转至细胞膜从而获得催化活性，激活（磷酸化）的Akt从细胞膜脱落进入细胞质或细胞核，从而调控细胞运动和凋亡［19］。研究显示，乳腺癌中SMC4可促进PI3K∕AKT信号通路表达［20］。本研究显示，KYSE170-siSMC4组p-PI3K和p-Akt表达水平明显低于Control组和KYSE170-siNC组（P＜0.05），提示下调SMC4表达可抑制PI3K∕AKT信号通路活性。

综上所述，下调SMC4表达可抑制人EC细胞增殖、侵袭和转移，并通过降低EMT相关分子N-cadherin表达抑制EMT进程，其作用机制可能与PI3K∕AKT信号通路有关。