咳嗽变异性哮喘患者血清中sPLA2-X含量与CysLT、iNOS、IL-33及FeNO的关系研究①

张翊玲 路 苹 郑梦凝 姚红梅（贵州省人民医院呼吸与危重症医学科，贵阳550002）

咳嗽是机体重要的防御性反射，有利于清除呼吸道分泌物和有害因子，但频繁剧烈的咳嗽会对患者造成各方面的严重影响。在呼吸专科门诊，咳嗽是最常见的求诊症状。在社区人群中，慢性咳嗽患病率大约为10%，在国内呼吸专科门诊中，慢性咳嗽患者可占三分之一甚至更高。临床常根据X线胸片检查有无异常，并将慢性咳嗽分为两类：一类为X线胸片有明确病变者，如肺炎、肺结核、支气管肺癌等；另一类为X线胸片无明显异常，以咳嗽为主要或唯一症状，即传统概念的慢性咳嗽。引起慢性咳嗽的病因众多，常见病因包括：咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma,CVA）、上气道咳嗽综合征（upper airway cough syndrome,UACS）、嗜酸粒细胞性支气管炎（eosinophilic bronchitis,EB）、胃食管反流性咳嗽(gestroesophageal refluxrelated chronic cough,GERC)变应性咳嗽（atopic cough,AC），上述病因约占慢性咳嗽病因的绝大多数。而CVA占比最高。CVA是一种特殊的哮喘，咳嗽是其唯一或主要临床表现，无明显喘息、气促等症状或体征，但有气道高反应性。临床表现主要表现为刺激性干咳，通常咳嗽比较剧烈，夜间咳嗽为其重要特征，感冒、冷空气、灰尘、油烟等诱发或加重咳嗽［1-5］。

sPLA2-X（分泌型磷脂酶A2-X）是在哺乳动物细胞中调节类二十烷酸最为关键的因素，sPLA2-X能够促进致病性炎症过程。研究发现支气管哮喘发病与sPLA2-X密切相关，在哺乳动物细胞中，sPLA2-X是调节花生酸类物最为关键的因素，sPLA2-X具有独立促炎催化功能以及具有介导花生酸类物的非酶机制，同时又具有强有力的水解活性。其主要生理功能为调节CysLTs（半胱氨酰白三烯）、AA、PG等类二十烷酸的生物合成从而实现对支气管哮喘发展的促进作用，CysLTs在哮喘气道中高度表达，能强烈诱导气道平滑肌的收缩，哮喘患者气道sPLA2-X活性升高增加CysLTs合成［6-10］。动物试验也表明缺乏sPLA2-X会减少CysLTs的生成。支气管哮喘患者血清中sPLA2-X及CysLTs与FeNO、iNOS等相关研究尚未报道，作为支气管哮喘的特殊类型，CVA患者是否与sPLA2-X及其重要产物CysLTs有一定的关联，且sPLA2-X是否对CVA有相应的影响，相关文献未见报道。

本研究旨在评估咳嗽变异性哮喘（CVA）患者血清中sPLA2-X、CysLTs、IL-33、IL-17、iNOS（诱生型一氧化氮合酶）及血清总IgE表达情况，还有肺功能和FeNO（呼出气一氧化氮）的情况。并探讨CVA患者血清中sPLA2-X含量是否与血清中IL-33、IL-17、iNOS含量及FeNO存在相关性，进一步研究sPLA2-X对CVA的影响，为咳嗽变异性哮喘的发病机制及治疗提供新的思路与策略，为该类的临床研究提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 病例纳入和排除标准 选取贵州省人民医院呼吸与危重症医学科2018年6月至2019年11月门诊确诊的CVA患者为研究对象及同期在我院健康体检中心体检的健康患者为对照组，分为CVA治疗前组（41例）和健康对照组23例。咳嗽变异性哮喘患者治疗前组（即门诊首次确诊，未规范治疗）。经规范治疗3月后为CVA治疗后组（41例）［即规范吸入沙美特罗氟替卡松粉剂（50 μg∕250 μg），1次1吸，每天2次，吸后清水漱口；口服用孟鲁司特钠咀嚼片10 mg，每晚1次］。经规范治疗3月后门诊复查肺功能、FeNO及血标本。诊断CVA依据：慢性咳嗽＞8周，常伴有夜间刺激性咳嗽；支气管激发试验阳性或PEF变异率≥20%，或支气管舒张试验阳性；经抗哮喘治疗有效。入选患者诉主要症状或首发症状为咳嗽，但入选患者病程不一，部分患者诉病程中出现过胸闷、气促。但首次在门诊确诊时查体未闻及哮鸣音。排除标准：慢性咳嗽的一些其他病因还包括慢性支气管炎、支气管扩张症、气管-支气管结核、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）等药物性咳嗽、支气管肺癌和心理性咳嗽等以及合并心脑血管系统、消化系统、泌尿系统、内分泌系统等疾病。咳嗽变异性哮喘治疗前组经孟鲁司特10 mg口服（1次∕d）及沙美特罗氟替卡松（50 μg∕250 μg）每日两次吸入，规范化治疗3月后于患者门诊再次抽血及复查肺功能、FeNO。本研究中的检测标本均为外周静脉血，咳嗽变异性哮喘患者治疗3月后门诊常规行肺功能及FeNO检查，故依从性较好，均已向患者告知并获知情同意。

1.1.2 分组 将研究对象分为健康对照组23例、CVA（咳嗽变异性哮喘）治疗前组41例、CVA（咳嗽变异性哮喘）治疗后组41例（原本有53例咳嗽变异性哮喘患者符合纳入标准，因部分患者用药不规律及部分患者失访，故最终纳入本研究的CVA患者为41例）。

健康对照组：选取贵州省人民医院体检中心健康志愿者23例作为健康对照组。无咳嗽表现，既往体健，无呼吸系统相关疾病如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病及其他慢性呼吸道疾病史；近1个月无呼吸系统等感染病史；查体均未见异常；血常规、尿常规、腹部超声、胸片均正常。

健康对照组与CVA组患者，年龄、性别、身高、体重、BMI、吸烟方面等一般资料比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

表1 两组一般资料对比（±s）Tab.1 Comparison of general data between two groups（±s）

表1 两组一般资料对比（±s）Tab.1 Comparison of general data between two groups（±s）

Groups Healthy control group CVA（cough variant asthma）group P n 23 41 Gender（male∕female）11∕12 22∕19＞0.05 Age（years）45.76±16.84 47.59±17.09＞0.05 Smoking（Yes∕No）7∕16 13∕28＞0.05 Height（cm）167.3±13.5 169.7±12.8＞0.05 BMI（kg∕m2）24.8±7.9 25.3±7.2＞0.05

1.2 方法 选取健康对照组体检者、确诊当天咳嗽变异性哮喘CVA患者与经孟鲁司特及沙美特罗氟替卡松规范化治疗3个月后的复查患者。抽静脉血5 ml，室温下静置1 h，3 000 r∕min离心10 min，得到上清液，血清样本保存在2℃～8℃之间，其余在-80℃下冷冻保存。ELISA方法检测血清sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-17、IL-33、总IgE含量。肺功能检测仪检测常规的肺功能指标如肺活量、肺总量、用力肺活量、残气量、最大呼气中期流速等，同时做支气管激发试验。取外周血上清液采用双抗体夹心ELISA试剂盒（sPLA2-X、CysLT试剂购买于R&D公司；iNOS、IL-17、IL-33试剂购买于BD公司；总IgE试剂购于eBioscience公司）检测血清中总IgE、sPLA2-X、CysLTs、IL-17、IL-33及iNOS的表达水平。严格按照ELISA试剂盒说明书操作。450 nm处酶标仪读取吸光度（A）值，制作相应的标准曲线，根据标准曲线，定量分析血清中总IgE、sPLA2-X、CysLTs、iNOS、IL-17、IL-33的表达水平［11］。观察指标：记录患者血清中sPLA2-X、CysLTs、IL-17、IL-33、iNOS以及FeNO、肺功能、血清总IgE等。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0软件对数据进行整理分析，所有数据均经过正态分布和方差齐性检验。正态分布的计量资料以±s表示，两组间计量资料比较采用t检验或配对t检验，非正态分布数据采用中位数（四分位距）表示。计数资料采用卡方检验；非正态分布采用Spearman进行相关性分析。采用GraphPad Prism6作图，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CVA患者治疗前后肺功能FVC pred%、FEV1 pred%、FEV1∕FVC（%）、MMEF pred%及血嗜酸性粒细胞绝对数、血清总IgE的比较 结果如表2所示：与CVA患者治疗前比较，CVA患者经治疗后其肺功能FVC pred%，FEV1 pred%，FEV1∕FVC（%），MMEF pred%均显著升高，差异具有统计学意义（P＞0.05）。CVA患者属于哮喘中的特殊类型，部分病程较长的患者已出现胸闷、气促等表现，故肺功能在治疗前FVC pred%、FEV1 pred%、FEV1∕FVC（%）、MMEF pred%有所下降，经治疗后FVC pred%，FEV1 pred%，FEV1∕FVC（%），MMEF pred%得到改善，该结果与临床实际情况相一致；外周血嗜酸性粒细胞绝对数无论在CVA治疗前还是治疗，均无显著升高，两组间差异不显著，无统计学意义（P＞0.05）；与CVA患者治疗前比较，CVA患者经治疗后血清中总IgE显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 CVA患者治疗前后肺功能及血嗜酸性粒细胞绝对数、血清总IgE的前后变化（±s）Tab.2 Changes of lung function，absolute number of blood eosinophils and total serum IgE in CVA pa⁃tients before and after treatment（±s）

表2 CVA患者治疗前后肺功能及血嗜酸性粒细胞绝对数、血清总IgE的前后变化（±s）Tab.2 Changes of lung function，absolute number of blood eosinophils and total serum IgE in CVA pa⁃tients before and after treatment（±s）

Parameters Lung function FVC pred（%）FEV1 pred（%）FEV1∕FVC（%）MMEF pred%Eosinophil absolute count（×106）Normal range（20×106～520×106）median（IQR）Total IgE in serum（U∕ml）Normal range（0～100）（U∕ml）median（IQR）CVA group before treatment（n=41）73.2±12.3 72.2±14.8 75.7±13.7 69.4±19.5 320（105～480）226（138～364）CVA group after treatment（n=41）84.6±11.5 87.9±10.2 85.7±8.6 80.3±22.1 295（87～436）85（70～162）P value＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.2 CVA患者治疗前后及健康对照组血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-17、IL-33以及CVA患者治疗前后FeNO变化情况（图1）。

2.2.1 CVA患者治疗前后及健康对照组患者血清中sPLA2-X表达情况 结果如图1A所示：与健康对照组比较，CVA治疗前患者血清中的sPLA2-X表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与CVA治疗前组比较，CVA治疗后组血清中sPLA2-X显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2.2 CVA患者治疗前后及健康对照组患者血清中CysLT表达情况 结果如图1B所示：与健康对照组比较，CVA治疗前患者血清中的CysLT表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与CVA治疗前组比较，CVA治疗后组血清中CysLT显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2.3 CVA患者治疗前后FeNO变化情况 结果如图1C所示：与CVA治疗前组比较，CVA治疗后组FeNO显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。CVA是支气管哮喘中的特殊类型，纳入的患者均为门诊患者以慢性咳嗽为首发症状，并于门诊第一次确诊，且首发症状以咳嗽为主，但具体病程不同，因入选的患者病程不一，就诊时部分患者已出现胸闷、气促等表现，严格意义上讲，其部分患者已接近典型的过敏性哮喘。因此出现FeNO值较高。

图1 CVA患者治疗前后及健康对照组血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-17、IL-33表达情况以及CVA患者治疗前后FeNO变化情况Fig.1 Expression of sPLA2-X，CysLT，iNOS，IL-17，and IL-33 in serum of CVA patients before and af⁃ter treatment and healthy control group and chang⁃es of FeNO in CVA patients before and after treat⁃ment

2.2.4 CVA患者治疗前后及健康对照组患者血清中IL-17表达情况 结果如图1D所示：与健康对照组比较，CVA治疗前患者血清中的IL-17表达无明显升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。与CVA治疗前组比较，CVA治疗后组血清中IL-17无明显降低，差异无统计学意义（P＜0.05）。

2.2.5 CVA患者治疗前后及健康对照组患者血清中IL-33表达情况 结果如图1E所示：与健康对照组比较，CVA治疗前患者血清中的IL-33表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与CVA治疗前组比较，CVA治疗后组血清中IL-33显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2.6 CVA患者治疗前后及健康对照组患者血清中iNOS表达情况 结果如图1F所示：与健康对照组比较，CVA治疗前患者血清中的iNOS表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与CVA治疗前组比较，CVA治疗后组血清中iNOS显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 CVA治疗前组血清中sPLA2-X含量与CysLT、FeNO、iNOS、IL-17、IL-33相关性 如图2所示：在CVA治疗前组，血清中sPLA2-X含量与CysLT、FeNO、iNOS、IL-33呈正相关（分别是r=0.854 7、0.622 9、0.644 9、0.778 9，P＜0.001，差异具有统计学意义），IL-17与血清中sPLA2-X含量无相关性（r=0.058 5，P=0.127 6，差异无统计学意义）。

图2 在CVA治疗前组，血清中sPLA2-X含量与CysLT、FeNO、iNOS、IL-17、IL-33相关性研究Fig.2 Correlation between sPLA2-X and CysLT，FeNO，iNOS，IL-17 and IL-33 in serum of CVA group be⁃fore treatment

3 讨论

慢性咳嗽是呼吸系统疾病常见症状，引起慢性咳嗽的病因很多，常见病因为咳嗽变异性哮喘、上气道咳嗽综合征、嗜酸性粒细胞支气管炎、胃食管反流性咳嗽及变异性咳嗽。上述病因约占慢性咳嗽病因的绝大多数，而CVA占比最高。CVA是一种特殊的哮喘，咳嗽是其唯一或主要临床表现，无明显喘息、气促等症状或体征，但有气道高反应性。研究发现支气管哮喘发病与sPLA2-X密切相关，在哺乳动物细胞中，sPLA2-X是调节花生酸类物最为关键的因素，sPLA2-X能够促进炎症过程。sPLA2-X具有独立的促炎催化功能，介导花生酸类物的非酶机制，同时又具有强有力的水解活性。其主要生理功能为调节CysLT、AA等类二十烷酸的生物合成从而实现对支气管哮喘发展的促进作用，CysLT在哮喘气道中高度表达，能强烈诱导气道平滑肌的收缩［6-10］。

结合本研究结果所示，与健康对照组相比，咳嗽变异性哮喘患者治疗前血清中sPLA2-X及其CysLT、iNOS、IL-33的表达明显升高，且差异具有显著统计学意义。咳嗽变异性哮喘为支气管哮喘的特殊类型，具有支气管哮喘的共性，研究表明支气管哮喘与sPLA2-X及CysLT、IL-33密切相关，本研究结果显示CVA患者治疗前血清中的sPLA2-X及CysLT显著升高，经规范化治疗后，CVA患者治疗后血清中的sPLA2-X及CysLT显著降低，该结果显示sPLA2-X及CysLT与咳嗽变异性哮喘存在重要的关联。研究表明，IL-33∕ST2通路与哮喘的发展有密切关联。IL-33作为Th2型细胞因子的重要诱生因素已被公认。其介导的IL-33∕ST2通路可广泛作用于Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞等，维持或加剧过敏性炎症反应。在有过敏原的情况下，IL-33能提高过敏原刺激后的Th2型细胞因子IL-5∕IL-13的分泌。IL-33能诱导嗜酸性粒细胞的超氧阴离子生成以及促使嗜酸性粒细胞脱粒释放IL-5，同时IL-33具有调节嗜酸性粒细胞黏附的作用及提高嗜酸性粒细胞的存活力。IL-33在哮喘发生发展中发挥重要的作用［12-16］。本研究中，CVA治疗前组患者血清中IL-33表达显著升高，经规范化治疗后，CVA治疗后组患者血清中IL-33表达显著降低，该结果表明CVA可能具有支气管哮喘的特点，与IL-33有重要的关联。且在CVA治疗前组血清中sPLA2-X表达与CysLT、IL-33呈正相关，该结果说明sPLA2-X、CysLT、IL-33与咳嗽变异性哮喘存在重要的关联。

FeNO本质是描述气道炎症的生物标记物，主要由炎症细胞诱导iNOS持续表达［17-21］。FeNO在临床上主要用于哮喘复发、评估依从性和指导治疗。FeNO与嗜酸性粒细胞炎症密切相关，高水平的Fe-NO可作为吸入性糖皮质激素（inhaled corticosteroids,ICS）治疗反应的敏感指标，而过敏患者FeNO升高是哮喘急性发作的独立危险因素。FeNO作为无创检测，能够反映气道炎症。本研究结果显示，CVA治疗前组FeNO明显高于治疗后组，咳嗽变异性哮喘多与嗜酸性粒细胞密切相关，对糖皮质激素治疗敏感，在本研究结果中，FeNO在治疗前组显著升高，与其他CVA相关研究相一致。FeNO与炎症细胞诱导iNOS表达呈正相关。诱生型一氧化氮合酶（iNOS）的激活与炎症介质、细胞因子、感染、缺氧等刺激因素密切相关。iNOS过度激活、引起大量的NO产生是机体损害的重要因素之一，iNOS表达水平与机体炎症反应的严重程度呈正相关。正常情况下，iNOS不产生NO；在缺血、缺氧、内毒素等激活条件下诱导iNOS mRNA的表达，合成iNOS，从而产生过量的NO可对缺血组织造成损害。FeNO与iNOS呈正相关，因此FeNO可间接反映气道炎症的严重程度［20-22］。本研究结果显示，CVA治疗前组血清中iNOS表达显著升高，经规范治疗后iNOS在CVA治疗后组血清中表达显著降低，该结果与相关研究相一致，均提示FeNO与iNOS呈正相关。同时，本研究血清中sPLA2-X含量与FeNO、iNOS呈正相关，该结果表明sPLA2-X、FeNO、iNOS均与咳嗽变异性哮喘存在重要关联。

在CVA治疗前组及CVA治疗后组，血清中IL-17无显著变化。在CVA治疗前组，IL-17与血清中sPLA2-X含量无相关性。支气管哮喘发病机制错综复杂，除Th2细胞外还有其他细胞参与调节哮喘的发生和发展。相关研究表明重症哮喘、难治性哮喘或激素抵抗型哮喘多与IL-17及中性粒细胞相关，糖皮质激素治疗效果差。这表明重症哮喘、难治性哮喘或激素抵抗型哮喘与产生IL-17的Th17细胞及中性粒细胞密切相关，而CVA是以嗜酸性粒细胞为主的Th2细胞型哮喘，而非Th17细胞及中性粒细胞型哮喘。IL-17可以通过促进释放前炎症细胞因子来放大炎症反应。IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效介导组织的炎症反应［23-26］。CVA糖皮质激素治疗效果好，CVA主要与嗜酸性粒细胞相关，相关研究尚未表明CVA与IL-17及中性粒细胞相关。本研究结果显示CVA治疗前组及CVA治疗后组，血清中IL-17无显著变化。在CVA治疗前组，IL-17与血清中sPLA2-X含量无相关性，与相关的研究一致。

本研究表明CVA患者为支气管哮喘特殊类型，其血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-33及总IgE显著升高，且FeNO显著升高。经治疗后血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-33显著降低，血清中sPLA2-X含量与CysLT、iNOS、IL-33及FeNO呈正相关。结果表明CVA与sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-33及FeNO显著相关，为CVA的发病机制及治疗提供新的思路与策略，为该类的临床研究提供一定的理论依据。