热疗及热休克蛋白对肿瘤免疫应答的影响△

智晓玉，李卫威，王少伟，燕翔，汪进良#

解放军总医院第一医学中心1肿瘤内科，2研究生院，北京 100853

3解放军第八十一集团军医院肿瘤内科，河北 张家口 075000

4天津医科大学肿瘤医院胃肠肿瘤生物学研究室，天津 300060

发热被认为是机体主要的防御机制之一，一些早期的抗肿瘤免疫治疗的经验表明，可通过发热来进行抗肿瘤治疗。19世纪60年代，William Coley发现，细菌毒素治疗有助于抑制肉瘤、淋巴瘤等肿瘤的进展，且其中高热患者的生存时间更长，证实了以免疫治疗为基础的抗肿瘤治疗的有效性，也促使加热治疗（简称热疗）成为抗肿瘤治疗的新手段。目前，以高热作为肿瘤治疗方法，并不是利用发热作为提高体温的来源，而是采用体外加热来升高温度。局部及局域热疗是最初的热疗手段，目前，全身热疗也被不断地探索且成果显著，于是，学者们对热疗能够有效抑制肿瘤生长的机制进行了进一步探究。本文在既往研究成果的基础上，将热疗及热休克蛋白（heat shock protein，HSP）对肿瘤患者先天性及获得性免疫应答的影响进行综述。

1 HSP的生成

1962年，Ritossa将果蝇幼虫的饲养温度从25℃提高至30℃，30 min后观察到了果蝇多丝染色体上的蓬松现象，提示这些区域的基因转录加强并可能导致某些蛋白质的合成增加。1974年，Tissières等研究结果证实，上述现象确实是由果蝇体温升高增强了这一区域的基因转录导致，并生成了一系列分子量为70 kD和26 kD的蛋白质，遂被命名为HSP。HSP可存在于多种亚细胞复合体中，如细胞质、细胞核、核仁、内质网、高尔基体、线粒体，是一类高度保守的蛋白质。生理条件下，大多数HSP作为蛋白伴侣持续表达，可调节蛋白折叠，促进蛋白复合物构成，调控蛋白降解；应激状态下，如高热、乏氧、葡萄糖剥夺、酸中毒、感染，HSP的表达均可迅速上调。人类基因命名委员会（Human Gene Nomenclature Committee，HGNC）依据HSP分子量将其分为HSPH（HSP110）、HSPC（HSP90）、HSPA（HSP70）、DNAJ（HSP40）、小分子HSP（small heat shock protein，sHSP）和 CCT（TRiC）。目前，已发现HSP在多种肿瘤组织中的表达水平高于正常组织。

2 热疗及HSP对肿瘤先天性免疫应答的影响

先天性免疫应答是人体抵御病原体的第一道防线。先天性免疫应答细胞包括树突状细胞（dendritic cell，DC）、巨噬细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞，其中NK细胞是主要的杀伤细胞。NK细胞通过表达多种激活和抑制受体来调控其对肿瘤细胞的杀伤作用。主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原（major histocompatibility complex antigenⅠ，MHCⅠ）作为效应T细胞对肿瘤细胞识别靶点的同时，也是NK细胞的抑制配体，部分肿瘤细胞为躲避T淋巴细胞的杀伤作用而上调MHCⅠ的表达，但却激活了NK细胞对它们的识别与杀伤作用。Ostberg等的研究发现，热疗主要是通过上调NK细胞表面激活受体2D（natural killer cell receptor group 2D，NKG2D）及其配体MHCⅠ类链相关蛋白A（major histocompatibility complex classⅠ-related chain A，MICA）的表达来促进NK细胞对人直肠癌细胞Colo205的杀伤作用。Gastpar等的研究发现，肿瘤细胞外泌体中的HSP70可以进一步提高NK细胞的转移及杀伤能力，且有相关研究发现，热疗还有助于NK细胞向肿瘤组织转移。

3 热疗及HSP对肿瘤获得性免疫应答的影响

获得性免疫应答主要由7个关键步骤组成（图1）：①肿瘤抗原的释放；②抗原呈递细胞对肿瘤抗原的摄取及呈递；③T细胞的激活及增殖；④T细胞向肿瘤组织转移；⑤T细胞浸润至肿瘤组织；⑥T细胞对肿瘤细胞的识别；⑦肿瘤细胞最终被杀伤。热疗及HSP可以增强此过程中的多个步骤的作用。

图1 肿瘤免疫应答流程图

3.1 抗原呈递细胞对抗原的摄取及呈递

在获得性抗肿瘤免疫应答过程中，DC是最主要的抗原呈递细胞（antigen presentation cell，APC）。肿瘤抗原被DC吞噬后将以HSP复合物的形式通过内源性抗原呈递途径交叉呈递给MHCⅠ类分子。热疗不仅可提高HSP的含量，还可以通过诱导免疫蛋白酶体的特殊亚单位LMP2和LMP7的表达来增强肿瘤抗原向DC呈递。接受抗原呈递后，DC将逐渐成熟并进一步转移至二级淋巴器官激活幼稚T淋巴细胞。Ostberg等的研究发现，热疗可促使小鼠体温升高至39.5～40.0℃，有助于诱导DC成熟并向淋巴结转移。进一步研究结果显示，HSP60、HSP70、HSP90、gp96均可以促进DC成熟，且HSP还可以通过诱导成熟DC分泌细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α，来进一步促进抗肿瘤免疫应答。

3.2 T细胞的激活与增殖

幼稚T淋巴细胞将于二级淋巴器官，如淋巴结、派尔集合淋巴结（Peyer’s patch，PP），与成熟DC表面主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）/肿瘤抗原复合物结合，从而获得免疫应答能力。热疗及HSP对幼稚T淋巴细胞转移至二级淋巴器官（归巢）及T淋巴细胞在二级淋巴器官的激活与增殖均有影响。

成熟DC及大多数幼稚T淋巴细胞可表达CCR7，其可以顺应二级淋巴器官分泌的细胞因子CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）19、CCL21的浓度梯度完成归巢。在归巢过程中，免疫细胞需要通过L-选择素、α4β7整合素与细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）进行结合穿过高内皮小静脉（high endothelial venule，HEV）后，才可最终到达淋巴结或PP。Evans等对小鼠进行6 h全身热疗（39.8±0.2）℃后发现，小鼠外周循环淋巴细胞数目减少的同时，PP及外周淋巴结（peripheral lymph node，PLN）中淋巴细胞数目明显升高数倍，表明热疗可以促进淋巴细胞归巢。进一步研究结果显示，热疗是通过提高HEV的ICAM-1、CCL2的表达，上调淋巴细胞的L-选择素及整合素的表达，来促进淋巴细胞与HEV的相互作用。Lin等的研究发现，热疗是通过促进HSP90与α4整合蛋白相互作用来增强T细胞的黏附与转移。

已有研究证实，热疗可以增强T淋巴细胞的应答能力。Mace等将 CD62LCD44表达的前黑素小体蛋白-1（premelanosome protein-1，Pmel-1）CD8T淋巴细胞与表达gp100肽的C57BL/6小鼠脾细胞进行抗原依赖性激活共培养，培养温度达到39.5℃时，分化为CD62LCD44的效应T细胞数量明显高于培养温度为37℃时；对该研究结果的原理进行了深入探究发现，热疗通过增强CD8T淋巴细胞的膜流动性，导致GM1CD微区、TCRβ及CD8共受体聚集，从而促使DC与T淋巴细胞结合更加紧密。另有相关研究发现，热疗是通过激活T淋巴细胞蛋白激酶（protein kinase，PK）C、PKCβ、PKCθ，以及蛋白激酶C1受体来促进T细胞的激活。Di等的研究发现，HSP70因与PKC共定位，在T淋巴细胞激活过程中发挥重要作用。同时，热疗及HSP60也可以通过促进效应T淋巴细胞IFN-γ的分泌来进一步影响免疫应答反应。

3.3 T细胞向肿瘤组织转移及浸润

幼稚T细胞分化为效应T细胞后，其表面的CCR7表达下调，有助于效应T细胞离开淋巴组织向肿瘤组织转移。Fisher等利用体内荧光显微术发现，一般情况下，小鼠肿瘤模型中CD8T淋巴细胞与肿瘤血管的相互作用较低，但给予热疗后CD8T淋巴细胞与肿瘤血管的相互作用可以提升至5倍以上。

3.4 T细胞对肿瘤细胞的杀伤

肿瘤组织中，效应T细胞通过T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别表达于肿瘤细胞表面的MHC/抗原复合物，并通过诱导细胞裂解或凋亡来对其进行杀伤。细胞裂解性杀伤指效应T细胞通过诱导分泌穿孔素和颗粒酶来杀伤肿瘤细胞；诱导细胞凋亡，即效应T细胞表达的Fas配体（Fas ligand，FasL）与肿瘤细胞表达的受体结合促使下游通路激活导致肿瘤细胞凋亡。相关研究显示，热疗可以通过诱导效应T淋巴细胞FasL的表达来促进肿瘤细胞凋亡。

在机体免疫系统抗肿瘤的过程中，肿瘤组织可以通过调节自身免疫微环境来逃避杀伤作用。调节性T（regulatory T，Treg）细胞可表达CD4、CD25和叉头框蛋白 P3（forkhead box P3，FOXP3），均是T淋巴细胞亚群。通过抑制免疫细胞（DC、NK、T细胞）增殖可以负向调节先天性和获得性免疫应答。Treg通常占CD4T细胞的5%～10%，但在肿瘤微环境中却可以高达20%～30%，导致多种肿瘤（卵巢癌、胸部肿瘤、肾癌、胰腺癌）患者的预后不良。相关研究发现，热疗可以降低肿瘤微环境中Treg细胞水平。程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）作为分子“防御”机制，可以保护肿瘤细胞免受效应T细胞的杀伤作用。Kokura等的研究发现，将培养温度升高至40～43℃时，肿瘤细胞系PD-L1的表达下调，表明热疗有利于改善肿瘤免疫微环境从而促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。

4 小结与展望

热疗及HSP可以对机体抵抗肿瘤免疫应答的多个方面发挥促进作用，但仍有许多潜在的问题需要进一步探究。首先，热疗方式（全身热疗、局部热疗、局域热疗）及热疗设备（微波热疗、超声波热疗、射频热疗、红外线热疗）多种多样，哪种选择可以给患者带来更多的获益尚需进一步探讨；其次，目前热疗温度为38.5～42.0℃，选择范围较宽，热疗温度选择的进一步精细化非常必要；有学者发现，HSP70可以有效抑制肿瘤（胰腺癌、前列腺癌、胃癌）细胞凋亡，且肿瘤组织中HSP（HSP27、HSP70、HSP90）表达上调对肿瘤转移有促进作用。因此，仍需进一步探讨在机体复杂环境下热疗及HSP对抗肿瘤治疗的影响，旨在能够使单纯热疗或热疗联合治疗（如联合放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等）给肿瘤患者带来更多的获益。