循环肿瘤细胞及磷酸酶张力蛋白同源物基因检测在Ⅲ期结直肠癌中的临床意义△

鄢少聪，应学明，赵建华，汪茜

景德镇市第一人民医院肿瘤科，江西 景德镇 333000

据国家癌症中心统计，2013年结直肠癌新增病例达60 900例，位居第4位。由于早期诊断困难，且容易复发转移等因素，很大部分患者预后较差，而肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）虽具有一定的预测价值，但也仅作为参考。近年来，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）检测在多种实体肿瘤中得到了应用，已被证实其计数的动态变化与肿瘤的疗效、复发、转移等具有一定相关性。磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能抑制肿瘤转录，与肿瘤病理分化及预后相关。本研究通过检测CTC及PTEN基因表达，探讨其与临床特征和预后的关系，为CTC及PTEN基因检测在预后判断和复发监测等方面提供依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月至2019年1月景德镇市第一人民医院肿瘤科收治的77例术后Ⅲ期结直肠癌患者。纳入标准：①年龄≥18岁；②术后病理检查明确诊断为Ⅲ期结直肠癌；③术前未行任何治疗；④体力状态评分为0～2分。排除标准：①既往有其他恶性肿瘤病史；②一般情况差不宜行抗肿瘤治疗；③不宜参加本试验。其中，男性51例，女性26例；年龄24～75岁，平均（54.0±3.5）岁；结肠癌40例，直肠癌37例；T期22例，T期40例，T期15例；N期57例，N期20例；分化程度：中分化43例，低分化34例。本研究经医院伦理学委员会批准，患者自愿参与并知情同意。

1.2 检测方法

于首次治疗前2 h采集患者外周血5 ml，采用CanpatrolCTC二代技术，用免疫磁珠负向去除外周血中白细胞，然后通过纳米膜过滤检出CTC，再对每个CTC进行分型，同时采用多重mRNA原位分析技术标记检测PTEN基因。

1.3 结果判断

细胞内CD45（-）、EpCAM（+）以及 CK8/18/19（+），显微镜下看到红色荧光信号，为上皮型CTC；细胞内同时见到绿色荧光和红色荧光信号，为混合型 CTC；细胞内 CD45（-），Vimentin（+）以及Twist（+），显微镜下可见绿色荧光信号，为间质型CTC（图1）。人工计数CTC个数，定义CTC计数≥3为CTC阳性。每例患者CTC中PTEN基因的表达程度分为3个等级：信号点1～2点为低表达，3～8点为中表达，≥9点为高表达。

图1 荧光显微镜下的CTC分型

1.4 随访

制订病例观察表，记录患者的临床资料。从入组时间开始计算，每3个月复查，随访内容包括肛门指诊、血CEA、胸腹部CT，直肠癌患者可复查盆腔MRI；1年内进行结肠镜检查。采用以患者复诊为主加电话联系的随访方式，随访至患者死亡、失访或2020年6月30日，其中5例患者失访。

1.5 统计方法

采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC与临床特征的关系

低分化结直肠癌患者CTC阳性率明显高于中分化患者，且随着T分期升高CTC阳性率升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；不同性别、年龄、肿瘤部位、CEA水平、N分期结直肠癌患者的CTC阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征的结直肠癌患者CTC情况的比较（n=77）

2.2 CTC分型与肿瘤临床分期及分化程度的关系

不同T分期、分化程度的结直肠癌患者上皮型CTC比例比较，差异均有统计学意义（χ=8.131、8.545，P＜0.05）；不同T分期、N分期的结直肠癌患者混合型CTC比例比较，差异均有统计学意义（χ=9.994、7.036，P＜0.05）；不同分化程度的结直肠癌患者间质型CTC比例比较，差异有统计学意义（χ=6.338，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床分期及分化程度结直肠癌患者的CTC分型

2.3 CTC与PTEN基因的相关性

Spearman相关性分析结果显示，CTC与PTEN基因表达水平呈负相关（P＜0.01）。（表3）

表3 CTC与PTEN基因的相关性分析

2.4 CTC阳性与阴性患者生存情况的比较

CTC阴性组患者的中位生存时间（overall sur-vival，OS）为19个月，明显长于CTC阳性组的14个月，差异有统计学意义（χ=11.608，P＜0.01）。CTC阴性组的中位无进展生存期（progression-free survival，PFS）为11个月，明显长于CTC阳性组的7个月，差异有统计学意义（χ=8.082，P＜0.01）。（图2、图3）

图2 CTC阴性组（n=32）与阳性组（n=45）患者的OS曲线

图3 CTC阴性组（n=32）与阳性组（n=45）患者的PFS曲线

2.5 不同分型CTC阳性患者与阴性患者生存情况的比较

上皮型、混合型CTC阴性组与阳性组患者的中位OS及中位PFS比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（图4～图7）。间质型CTC阴性组患者的中位OS为19个月，长于阳性组患者的15个月，间质型CTC阴性组患者的中位PFS为11个月，长于阳性组患者的7个月，差异均有统计学意义（χ=4.679、5.324，P＜0.05）（图8、图9）。

图4 上皮型CTC阴性组（n=50）与阳性组（n=27）患者的OS曲线

图5 上皮型CTC阴性组（n=50）与阳性组（n=27）患者的PFS曲线

图6 混合型CTC阴性组（n=21）与阳性组（n=56）患者的OS曲线

图7 混合型CTC阴性组（n=21）与阳性组（n=56）患者的PFS曲线

图8 间质型CTC阴性组（n=44）与阳性组（n=33）患者的OS曲线

图9 间质型CTC阴性组（n=44）与阳性组（n=33）患者的PFS曲线

2.6 PTEN基因低表达与中表达患者生存情况的比较

PTEN基因低表达患者的中位OS为10个月，明显短于中表达患者的19个月，差异有统计学意义（χ=23.676，P＜0.01）。PTEN基因低表达患者的中位PFS为5个月，明显短于中表达患者的11个月，差异有统计学意义（χ=17.644，P＜0.01）。（图10、图11）

图10 PTEN低表达组（n=13）与中表达组（n=30）患者的OS曲线

图11 PTEN低表达组（n=13）与中表达组（n=30）患者的PFS曲线

3 讨论

近年来，结直肠癌的发病率呈上升趋势，且在发达国家中的发病率明显高于发展中国家。早诊断、早治疗、预后监测是提高肿瘤患者生存率、降低病死率的关键。CTC携带有原发肿瘤组织或转移灶的表型和遗传型，痕量存在于外周血中，取样便捷。越来越多研究表明，CTC检测可成为一种新型、非创性的诊断方法，是精准医疗的一个重要研究方向，在临床上发挥重要作用。既往研究显示，通过CellSearch系统检测外周血CTC是最常用的方法之一。但采用该检测系统无法富集到间质型CTC，因此，存在一定的局限性。本研究采用CanpatrolCTC二代技术，用免疫磁珠负向去除外周血中白细胞，然后通过纳米膜过滤检出CTC，同时根据上皮-间充质相关标志物的表达情况，采用RNA-ISH对CTC进行分型鉴定，使早期肿瘤精准诊断成为可能。

本研究共纳入术后Ⅲ期结直肠癌患者77例，有63例患者检出了CTC，检出率达81.8%，与Zhao等研究的检出率86.9%相近。有数据显示，当Cut-off值为3时，CTC检测可对患者良恶性作出较好区分，因此，本文亦采用3为Cut-off值，阳性率为58.4%（45/77），说明肿瘤细胞在早期就已存在于患者血液中，并可能出现转移，而TNM分期无法早期预判肿瘤的微转移，这也提示Ⅲ期患者需要进行充分的辅助治疗。

本研究发现，随着T分期升高，CTC阳性率升高，差异有统计学意义，与其他学者的结果相似，证实CTC与肿瘤侵犯深度有明显的相关性。研究发现CTC的检出率与病理分期有显著的相关性。另外，本研究结果显示，肿瘤分化程度低，CTC阳性率则高，差异有统计学意义，这与既往研究结果不一致，需扩大样本进一步证实。CEA是结直肠癌诊断和监测治疗反应的重要标志物，高CEA水平可能与结直肠癌进展相关，也有研究显示，CEA异常组CTC阳性率也高于CEA正常组，本研究中CTC与CEA并无相关性。对CTC分型后，统计出上皮型、混合型、间质型CTC比例分别为35.1%、72.7%、42.9%，并发现，不同T分期、N分期的结直肠癌患者混合型CTC比例比较，差异均有统计学意义；不同分化程度的结直肠癌患者间质型CTC比例比较，差异有统计学意义。这项结果既往未见报道，而这和CTC与患者临床特征的关系大致相符。

多项研究提示CTC可以作为转移性结肠癌患者的预后指标。Gennaro等也发现，CTC＜3的结直肠癌患者3年PFS长于CTC≥3者。在本研究中，CTC阴性组患者中位PFS和中位OS均明显长于CTC阳性组，差异均有统计学意义，说明CTC是与Ⅲ期结直肠癌患者生存时间密切相关的指标，但能否作为临床预后的决定性因素，还需要进一步研究。对CTC分型后，研究发现，在乳腺癌中，随着病情的不断恶化，间质型细胞比例会随之升高，在肝细胞肝癌中，转移患者的间质型CTC阳性率明显高于无转移患者，提示间质型CTC具有较强的转移侵袭及抗凋亡能力。本研究结果显示，在结直肠癌患者中，仅间质型CTC阴性组和阳性组患者的生存时间有显著差异，这与间质型CTC的侵袭能力密切相关，也说明间质型CTC可能是影响肿瘤患者预后的主要CTC类型。

PTEN基因通过与多种基因协同作用抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路，抑制肿瘤细胞转录。研究表明，PTEN与细胞的生长发育、分化及肿瘤的发生、转移和预后均有关。在卵巢癌中，有学者发现PTEN高表达患者的生存期是低表达者的2.5倍，认为PTEN可作为无病生存期的预测指标。本研究也发现，在Ⅲ期结直肠癌患者中，PTEN基因中表达患者较低表达患者生存时间长。有研究表明，PTEN低表达会增加结直肠癌患者的局部复发风险，并提高肿瘤细胞对放化疗的耐受性。另外，本研究结果显示，CTC与PTEN基因表达情况呈负相关，提示CTC低表达且PTEN高表达患者预后较好。

综上所述，CTC及PTEN与结直肠癌的发生、发展密切相关，可作为预测结直肠癌患者预后的指标，可以考虑在患者首诊时进行常规检测。另外，本研究病例数有限，结果在一定程度上存在偏倚，需要更大宗的病例以及多中心研究进一步证实。