一个Ⅱ型遗传性抗凝血酶缺陷导致深静脉血栓形成的家系分析

薛雁 谢海啸 徐琦煜 谢耀盛 蒋淑婷 王欢欢 王明山 杨丽红

抗凝血酶（antithrombin,AT）是机体重要的生理性抗凝物质，主要由肝细胞合成[1]。遗传性AT缺陷症是由位于染色体1q25.1的SERPINC1基因缺陷导致的常染色体显性遗传的血栓性疾病，大多数突变表现为杂合子[2]。根据血浆AT活性（AT activity，AT∶A）和AT抗原（AT antigen，AT∶Ag）水平，AT缺陷症可以分为两型：Ⅰ型表现为AT∶A和AT∶Ag同步降低；Ⅱ型表现为AT∶A降低，而AT∶Ag含量正常。笔者对1例由SERPINC1基因缺陷引起Ⅱ型遗传性AT缺陷症导致深静脉血栓形成的患者及其家系成员进行表型与基因型检测，并采用生物信息学软件分析突变位点的致病性和对蛋白结构的影响，探讨该Ⅱ型遗传性AT缺陷症与深静脉血栓形成的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者男，74岁。2020年2月16日在家中因突发左侧上下肢体无力摔倒被送至当地医院，头颅CT检查显示右侧额顶叶出血进入脑室，随即予以甘露醇针剂等对症治疗，症状无明显加重，随后送至温州医科大学附属第一医院进一步诊治。患者既往有高血压病史5～6年，期间未按照医嘱规范服用降血压药，无肝、肾病史及手术史。头颅MRI检查结果提示为“右侧额顶叶-中线旁病变”，随即予控制血压、脱水降颅内压、抗感染等治疗方案，拟“肺部感染、高血压病、脑出血”收治入院。入院4 d后，先证者B超检查显示“双侧下肢大动脉粥样硬化、两侧小腿肌间静脉丛血栓形成”，且静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism,VTE）为“高风险血栓形成”。对先证者进行了易栓症遗传性危险因素的筛查予以查明血栓形成原因，结果显示先证者AT∶A降低为32%，其他指标均在正常参考范围。通过调查该家系成员（3代11人）临床资料发现，家系成员中只有先证者出现相应临床表现，家系图见图1。采用随机抽样法选取本院2020年2月1日至2月14日100名无肝肾功能疾病和异常出凝血疾病的健康体检者作为正常对照，用于建立实验室各项指标参考范围及排除基因多态性可能，其中男50名，女50名，中位年龄54（36，64）岁。本研究经本院医学伦理委员会批准（伦审201217），研究对象均知情同意。

图1 遗传性AT缺陷症家系图

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 采集所有受试者外周静脉血2.7 ml加入含0.3 ml枸橼酸钠（浓度：0.109 mol/L）抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，离心半径20 cm；分离的乏血小板血浆用于凝血指标检测；下层血细胞用于提取基因组DNA、PCR扩增及测序。。

1.2.2 血浆凝血指标检测 在法国Stago公司的STAR-Max自动血凝仪上采用发色底物法检测AT∶A和蛋白C活性（PC∶A），凝固法检测蛋白S活性（PS∶A），酶联免疫吸附法检测AT∶Ag。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 PCR扩增基因组DNA 通过Primer Primer 6.0软件设计覆盖SERPINC1基因所有外显子及其侧翼序列的引物，并通过基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST）验证；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列参见文献[3]；在ABI Thermal cycler 2720扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上扩增SERPINC1基因组DNA及其侧翼序列。扩增完成的PCR产物经纯化后送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行测序；采用Chromas软件将测序结果与NCBI基因库公布的SERPINC1标准序列（GenBank ID：NG_012462.1）进行比对，寻找突变位点，再反向测序验证；然后扩增家系其他成员及健康对照组相应位点并测序。

1.2.4 生物信息学软件分析 采用MutationTaster、PolyPhen-2和LRT生物信息学软件分析突变氨基酸对蛋白质功能的影响；通过ClustalX-2.1-win多重序列比对软件分析突变氨基酸的保守性；根据已知蛋白数据库中AT蛋白模型文件（PDB ID：1ANT）构建三维立体空间模型图，用PyMol软件分析突变前后蛋白的空间结构和次级键的变化。

2 结果

2.1 表型检测结果 先证者及其大儿子、二女儿和外孙女的AT∶A显著降低，分别为正常对照的32%、43%、52%和48%；先证者及其家系成员PC∶A、PS∶A及AT∶Ag指标均无明显异常，表现为Ⅱ型遗传性AT缺陷症。基因检测结果见表1。

表1 遗传性AT缺陷症家系表型和基因检测结果

2.2 基因型检测结果 先证者SERPINC1基因第7号外显子存在c.1346T＞A杂合错义突变，导致氨基酸第417位的亮氨酸突变为谷氨酰胺（p.Leu417Gln）；其大儿子、二女儿和外孙女也携带该突变，家系其余成员该位点均为野生型，见图2。检测健康对照组该位点，未发现相同突变，排除了基因多态性可能。经查阅文献和人类基因突变数据库，该突变位点鲜见报道。

图2 SERPINC1基因第7号外显子测序图（a：野生型；b：c.1346T＞A突变型）

2.3 生物信息学软件分析结果 MutationTaster、Poly-Phen-2和LRT 3个在线生物信息学软件对p.Leu417Gln预测结果分别为1.0分、1.0分和0分，均显示为“致病的、有害的”。保守性分析显示Leu417在9种同源物种中高度保守，见图3。蛋白模型图显示，突变前非极性Leu417主链与极性Ser52侧链和极性带负电荷Glu414侧链分别形成一条氢键，当突变为极性Gln417后，Gln417与Leu126形成一条新的氢键，见图4。

图3 Leu417位点同源物种保守性分析

图4 p.Leu417Gln突变模型分析（a：野生型；b：突变型；虚线表示氢键）

3 讨论

易栓症是指包括遗传性和获得性因素存在而易发血栓栓塞的一类疾病[4]。临床常见遗传性因素有蛋白S、蛋白C、AT等抗凝蛋白缺乏以及凝血因子ⅤLeiden和凝血酶原G20210A突变；获得性因素包括创伤、妊娠、手术和制动、雌激素治疗等[5]。本研究中先证者SERPINC1基因第7号外显子存在c.1346T＞A杂合错义突变（p.Leu417Gln），其大儿子、二女儿和外孙女也携带该突变。根据已检测的AT∶A和AT∶Ag结果发现4名携带p.Leu417Gln杂合错义突变的家系成员AT∶A均有不同程度的降低，而AT∶Ag无明显异常，4名家系成员均不存在肝肾疾病史，初步认定为Ⅱ型遗传性AT缺陷症并且p.Leu417Gln杂合错义突变可能是导致该家系AT∶A降低的主要原因。

本研究中携带p.Leu417Gln突变的先证者与其3名家系成员均表现为AT∶A降低，先证者下肢深静脉血栓形成出现于因“高血压病、肺部感染、脑出血”被本院收治，其他3名家系成员均无相应临床症状，因此推断该杂合突变在其他危险因素存在时可能引起血栓形成。临床研究中，早期血栓形成、血栓家族史、复发性和突发性血栓等血栓形成事件皆与AT缺陷症相关。40%VTE形成与高龄、妊娠、高血压、吸烟、外科手术和长期制动等危险因素相关，60%VTE是由AT缺陷症自发形成[6]。该先证者由于同时存在长期制动、高血压、高龄等易栓因素，p.Leu417Gln杂合错义突变可能是另外一个易栓诱因。3个生物信息学软件分析显示p.Leu417Gln突变为“致病的、有害的”，可能会导致AT缺陷，进一步验证了笔者推测。本研究通过PyMol蛋白模型分析软件分析野生型AT蛋白在p.Leu417Gln突变后对空间结构和次级键的改变，结果显示：野生型AT蛋白非极性Leu417突变为极性Gln417后，与Leu126之间增加了一条氢键，这可能会导致局部分子间空间结构的改变。保守性分析结果为高度保守，表明该位点氨基酸对AT蛋白的结构形成和功能运用中起到重要作用。AT蛋白是一种由432个氨基酸组成的糖蛋白，二级结构具有3个β-折叠和9个α-螺旋。临床上常见导致PE型缺陷的基因位点均位于由s1C与s1C-s4B相连接的远端铰链区域[7]。现今报道的PE型缺陷如 p.Pro407Leu[8]、p.Val426Gly 和 p.Phe408Ser[9]、p.Arg425Thr[10]等主要位于7号外显子C末端。本研究中探讨的位于s4B与s5B连接处的p.Leu417Gln突变位点邻近其他报道的PE型突变位置，故此p.Leu417Gln杂合错义突变也可能有相似致病机制导致PE型缺陷。

综上所述，本研究通过对一个遗传性AT缺陷症家系表型和基因分析，分析了先证者出现下肢深静脉血栓形成可能与p.Leu417Gln杂合错义突变有关；进一步采用在线生物信息学软件及Pymol蛋白分析软件，初步探讨了其致病机制，但其确切的分子致病机制仍需进一步研究探讨。