葛根素对糖尿病KKAy小鼠氧化应激损伤的干预机制

邹 洁，张德德，陶 毅，赵 静，王 琼，徐乃佳

(武汉市中医医院,湖北 武汉 430050)

糖尿病是由胰岛素不足或者绝对缺乏导致的慢性疾病，临床表现为血糖持续升高，该病发病多伴有多器官组织功能损伤，严重影响患者生活质量[1-2]。《中国2型糖尿病防治指南》[3]指出，2015-2017年我国18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%，逐渐表现出年轻化的趋势。糖尿病发生主要由免疫系统、神经内分泌系统等多组织、多系统共同作用导致。中医学中无糖尿病的病名，根据患者临床表现可将其归属为“消渴”，该病最早记录于《素问·奇病论》中:“此人必数食甘美而多肥也,肥者令人内热,甘者令人中满,故其气上溢,转为消渴”。随着社会经济的进步，人们的饮食趋于多元化，生活压力增加，消渴的病机是本虚标实，肾虚为本，燥热、瘀热、湿热为标。葛根素是从植物葛根中提取的异黄酮类衍生物，研究表明[4-5]，葛根素能有效促进胰岛细胞的生成，改善氧化应激损伤，但具体机制不明确。糖尿病的病因病机极为复杂，目前尚不明确，氧化应激损伤是主要影响糖尿病发病的因素之一。中医学在治疗消渴病有足够的经验，中药组方或单味中药及对糖尿病的预防和治疗有显著作用，且不良反应小，价格低廉，是目前研究热点。本研究通过对葛根素在KKAy糖尿病小鼠氧化应激反应的干预作用及对骨形态发生蛋白-2 (Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表达的影响，分析葛根素在糖尿病治疗中的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性10周龄KKAy小鼠和C57BL/6J健康小鼠，购自武汉大学实验动物中心，动物合格证号[SCXK(鄂)2020-0001]。小鼠自由饮水和进食，平均体重(25±2)g。本实验研究经我院实验伦理委员会批准，并符合国家相关动物道德准则。

1.1.2 实验药品：普通饲料购自武汉大学实验动物中心，高脂饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司。配料组成：10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、0.5%胆酸钠、67%基础饲料。葛根素注射液(2 ml∶100 mg，批号H20054812)；盐酸二甲双胍片(0.5 g/片)。丙二醛 ELISA试剂盒(批号E201902)，超氧化物歧化酶ELISA试剂盒(批号E2012011)，小鼠内皮素1 ELISA试剂盒(批号E202006)，谷胱甘肽过氧化酶ELISA试剂盒(批号E202008)。血管内皮生长因子抗体(批号F20012)，骨形态发生蛋白-2抗体(批号F16003)。PCR试剂盒(批号HGEB200015)，BCA蛋白含量检测试剂盒(批号HGEB401210)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(批号HGEB75014)。

1.1.3 实验仪器：本次研究采用的主要仪器包括血糖仪(美国强生公司)、低温高速离心机(法国Jouan公司)、Benchmark Plus 酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD公司)、显微镜(日本 Olympus 公司)、RT-PCR 逆转录试剂盒(美国 Promega 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与干预:将10周龄KKAy小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、葛根素组，每组10只，10只C57BL/6J小鼠作为对照组。对照组小鼠采用普通饲料喂养，KKAy小鼠采用高脂饲料喂养。所有小鼠生存环境及其他饲养条件一致。对照组、模型组小鼠予4.3 ml/(kg·d)的0.9%氯化钠溶液灌胃；二甲双胍组小鼠给予二甲双胍200 mg/(kg·d)灌胃；葛根素组小鼠给予葛根素注射液1.3 ml/(kg·d)灌胃，各组均持续干预4周。

1.2.2 糖代谢指标含量分析：干预结束后禁食8 h，尾静脉采血检测四组小鼠空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin,HbAlc)。放免法检测四组小鼠空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)。采血检测四组小鼠餐后2 h血糖(2h postprandial blood glucose,2hBPG)。

1.2.3 胰腺组织形态学变化分析：小鼠处死后取部分胰腺组织石蜡切片脱蜡至水，切片加入苏木素染色5 min后冲洗，再加入伊红染色后脱水封片，显微镜下观察分析各组小鼠胰腺组织细胞形态学变化。

1.2.4 氧化应激相关指标分析：小鼠处死后心脏取血2 ml，置于离心机中，转速3000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min后取试管上清液，酶联免疫法分析各组小鼠血清中氧化应激相关指标丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、血浆内皮素-1(Plasma endothelin-1，ET-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)含量变化。

1.2.5 胰腺组织BMP-2和VEGF蛋白表达分析：取各组小鼠部分胰腺组织加入RIPA裂解缓冲液，收集小鼠胰腺组织中蛋白样品，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组小鼠胰腺组织中蛋白质的浓度。蛋白质样品中加入适量SDS-PAGE凝胶进行电泳，冰浴中转膜至PDVF膜上，洗涤液漂洗后置于4 ℃下封闭过夜，添加一抗与Actin孵育过夜，洗涤后添加二抗，洗涤3次后ECL试剂进行显影，分析蛋白相对表达情况。

1.2.6 RT-PCR法检测BMP-2和VEGF mRNA表达：RNA抽提试剂盒提取不同组小鼠胰腺组织中总RNA量，应用Primer5.0在逆转录试剂盒反转录获取cDNA后设计引物序列，RT-PCR法检测各组大鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF mRNA表达量，采用 2-△△Ct方法分析数据。引物序列，见表1。

表1 扩增引物序列

2 结 果

2.1 各组小鼠糖代谢指标含量比较 见表2。模型组小鼠血清中FPG、2hBPG、HbAlc含量均高于对照组，而FINS低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干预后，二甲双胍组、葛根素组小鼠血清中FPG、2hBPG、HbAlc含量均低于模型组，而FINS水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组小鼠糖代谢指标含量比较(ng/ml)

2.2 各组小鼠胰腺组织形态学比较 对照组小鼠胰腺组织细胞排列紧密，结构完整，胰岛细胞生长均匀旺盛，细胞质丰富无空泡；模型组小鼠组织间隙增宽，细胞排列紊乱形态不完整，细胞核损伤严重，有明显的空泡；经干预治疗后，二甲双胍组、葛根素组小鼠出现组织形态恢复改善，损伤有所减轻，胰岛细胞排列紧密，空泡减少(图1)。

A：对照组；B：模型组；C：二甲双胍组；D：葛根素组

2.3 各组小鼠氧化应激相关指标比较 见表3。模型组小鼠血清中MDA、ET-1含量均高于对照组，SOD、GSH-Px含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干预后，葛根素组小鼠MDA、ET-1含量均低于对照组，SOD、GSH-Px含量均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组小鼠氧化应激相关指标比较

2.4 各组小鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF mRNA表达量比较 见表4。模型组小鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF mRNA表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干预后，二甲双胍组、葛根素组的BMP-2和VEGF mRNA含量均低于模型组，且葛根素组最低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组小鼠胰腺组织中BMP-2、VEGF mRNA表达量比较

2.5 各组小鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF蛋白表达量比较 见表5(图2)。模型组小鼠胰腺组织中BMP-2、VEGF蛋白表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干预后，二甲双胍组、葛根素组小鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF蛋白表达量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组小鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF蛋白相对表达量比较

A：对照组；B：模型组；C：二甲双胍组；D：葛根素组

3 讨 论

糖尿病是临床常见代谢性疾病，病程长久，并发症多，且随着人们饮食结构改变和生活水平的改变，糖尿病发病率在全球呈现出增高趋势。糖尿病发病多与微循环障碍、代谢异常、基因多态性等因素有关[6]。葛根素是提取自中药葛根的黄豆甙元8-C-葡萄糖甙化合物。研究显示，葛根素能够有效抑制免疫炎症反应，改善微循环，提升血清胰岛素水平，降低组织过度氧化应激导致的胰腺细胞损伤[7-8]。随着社会经济的进步，人们的饮食趋于多元化，生活压力增加，糖尿病的患病率明显增加，消渴的病机是本虚标实，肾虚为本，燥热、瘀热、湿热为标。糖尿病病因病机极为复杂，目前尚不清晰，但在糖尿病的发病机制中，氧化应激损伤是主要影响因素之一。中医学治疗消渴病有足够的经验，中药组方或单味中药对糖尿病的预防和治疗有显著作用，且不良反应小，价格低廉[9-11]。

糖尿病发病初期，机体氧化应激引起的细胞受损与抗氧化平衡紊乱导致的组织间炎症，是导致胰腺组织细胞功能失调的主要原因[12-13]。机体抵御组织间自由基导致的氧化损伤的重要屏障是抗氧化酶系统，在降低糖脂水平时进行抗自由基氧化治疗，能够有效提高胰岛细胞的敏感性，从而改善葡萄糖耐受水平。SOD、MDA、ET-1、GSH-Px是反映机体氧化应激水平的主要指标。SOD可清除组织间多余的自由基，保护细胞免受自由基损害[14]。MDA是自由基氧化反应最终产物，其含量变化是脂质过氧化的体现，间接反映细胞损害程度[15]。ET-1是机体内重要的缩血管多肽，能够舒张血管，抑制内皮细胞增值，并且能够促进血管收缩，维持血管内环境稳态[16-17]。GSH-Px是体内不可缺少的过氧化物分解酶，是机体重要的抗过氧化能力指标之一，GSH-Px可催化谷胱甘肽转化为氧化型谷胱甘肽，保护细胞膜结构及功能不受过氧化物的损害[18]。BMP-2是TGF-β家族之一，在血液中能够促进毛细血管内皮细胞的增殖，对血管重建具有重要意义[19]。VEGF主要通过特异性的受体作用于血管中的内皮细胞，通过调控血管内皮细胞的增殖从而影响微血管的形成[20]。

本次探究结果显示，模型组小鼠与对照组相比，小鼠胰腺组织损伤严重，组织细胞形态不完整，并伴有明显的空泡，血清中MDA、ET-1、SOD、GSH-Px含量发生明显变化，这表明糖尿病KKAy小鼠出现明显的氧化应激损伤，而且胰腺组织中BMP-2和VEGF mRNA及蛋白表达明显变化，这与糖尿病的发病机制一致。与模型组相比，葛根素干预能够明显改善KKAy小鼠氧化应激反应，降低血糖，改善KKAy小鼠胰腺组织细胞形态，而且能够有效的调控小鼠胰腺组织中BMP-2和VEGF蛋白及mRNA的表达。

综上所述，葛根素可改善糖尿病KKAy小鼠胰腺组织损伤，降低氧化应激反应，调控BMP-2、VEGF蛋白及基因的表达，为葛根素后续治疗糖尿病提供了新思路。