益心附葶饮对主动脉缩窄大鼠心肌纤维化及p38MAPK/NF-κB p65信号通路的影响

张 妍，周纳纳，韩 茹，刘 婧，雷瑗琳

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西安市中医医院心内科，陕西 西安 710021)

近年来，心血管疾病病死率逐年攀升，且多种心血管疾病的发生都与心肌纤维化密切相关。心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)是多种原因导致心脏结构和功能改变的代偿及修复结果，但过度心肌纤维化会导致心功能逐渐减退，是心功能由代偿期过度为失代偿期的关键[1]。长期血压升高，心室后负荷过重是造成心肌纤维化的重要诱因。研究显示，在高血压心肌纤维化过程中免疫系统被激活，炎症反应可直接或间接参与高血压心肌纤维化的病理生理进程，造成心肌损伤和结构重塑，促使心力衰竭的发生发展[2]。在应激反应中p38MAPK/NF-κB p65信号通路对机体有保护作用，但当其被过度激活时会产生促炎因子而加重炎症反应过程，故抑制此通路成员能够明显改善心肌纤维化[3]。近年来，西医在其治疗方面尚存在局限性，如长期用药易出现耐药性、不良反应等，而中医学能够多层次、分阶段治疗，利于应对心血管疾病病程长且证候复杂多变的特点，优势凸显。益心附葶饮由黑附片、葶苈子、白术、太子参等药物组成，具有温阳化气利水之功效，是雷瑗琳主任医师根据长期临床经验总结而成的治疗慢性心力衰竭经验方，对心衰患者疗效较好。既往大量动物实验和临床研究表明，益心附葶饮不仅能够强心，还能减少炎症因子的释放，具有抑制心室重构、延缓心衰进程的作用[4-5]。因此，本实验通过观察腹主动脉缩窄大鼠心肌组织中胶原纤维比例1型胶原蛋白(Collagen 1)、3型胶原蛋白(Collagen 3)、p38MAPK和NF-κB p65蛋白的表达水平，探讨益心附葶饮能否通过干预p38MAPK/NF-κB p65信号通路缓解炎症反应，达到防治慢性心力衰竭的目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：清洁级雌性SD大鼠50只，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物质量许可证号SCXK(川)2020-035，平均体重(230±20)g。

1.1.2 实验试剂：Western、IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自上海碧云天生物公司，Immobilon-PSQ PVDF 膜购自美国Sigma-Aldrich公司，甘氨酸、Tris for molecular biology、SDS均购自德国Biofroxx公司，ECL发光试剂盒、兔源p65抗体、兔源GAPDH抗体均购自美国Affinity Bioscience公司，预染蛋白Marker、兔源Collagen 1抗体、兔源p38MAPK抗体均购自湖北Abclonal公司，兔源Collagen 3抗体购自美国Proteinteach公司。

1.1.3 实验仪器：转轮式切片机(德国徕卡公司)，JT-12S自动组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)，BMJ-A型包埋机(常州中威电子公司)，RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司)，PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪有限公司)，数字切片扫描仪Pannoramic 250(济南丹吉尔电子有限公司)，Image-Pro Plus 6.0软件(美国Cybernetics公司)，垂直电泳槽JY-SCZ4+(北京君意东方电泳设备有限公司)，电泳仪JY200C(北京君意东方电泳设备有限公司)，水平脱色摇床TY-80A(江苏科析仪器有限公司)，化学发光凝胶成像仪5200(上海天能科技有限公司)，全功能酶标仪MK3(美国ThermoFisher仪器有限公司)，超低温冰箱DW-86L386(海尔集团)，高速低温离心机H2050R(湖南湘仪集团)，优普超纯水制造系统(成都超纯科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 益心附葶饮：黑附片(先煎)20 g，炒葶苈子、茯苓皮、太子参、丹参各30 g，桂枝、川芎、麦冬各12 g，生白术、生地黄各15 g，醋五味子6 g，炙甘草10 g，以上药物由西安市中医医院制剂科提供颗粒剂制备。

1.2.2 建模、分组及给药：大鼠常规喂养1周，采用腹主动脉缩窄法制做心衰大鼠模型。用10%水合氯醛麻醉大鼠，开腹后分离出腹主动脉，以钝性7号针头4号线结扎，结扎后观察到肾脏缺血变白，迅速抽出针头，缝合关腹。连续3 d腹腔注射青霉素4万IU/d预防感染。将造模成功大鼠30只，采用随机数字表法分为模型组、中药组，每组15只，常规饲养的20只大鼠随机取15只作为假手术组。根据体表面积计算灌胃大鼠剂量，中药组每只灌胃3.5 g/(kg·d)益心附葶饮，模型组与假手术组以等体积蒸馏水灌胃，各组持续给药时间为8周。

1.2.3 Masson染色与心肌纤维化检测：大鼠处死后，解剖并暴露剥离心脏，洗净血液，分离左室，于左室最大横径处横切开，将左心室分为两部分。一部分组织甲醛固定、石蜡包埋、Masson染色后切片，每张切片放大100倍，先观察整体组织，再根据组织大小及表达情况分别选取3个区域，放大400倍采集图像。每个部位选3个视野，用Image Pro Plus 6.0软件测量胶原纤维面积与所选视野面积的比值作为心脏胶原容积分数(Collagen Volumetric Fraction，CVF)。

1.2.4 Western blot检测Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达：利用RIPA裂解液和组织破碎仪将心肌组织破碎成组织匀浆液，4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清液。电泳：利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定，将定量好的蛋白组织匀浆液加入合适体积的loading buffer，上样前蛋白样品95 ℃煮15 min，冷却后置于-80 ℃低温冰箱贮存。每孔组织蛋白上样量相等，置于电泳缓冲液中电泳，分离目的蛋白。转膜：采用Image J软件进行灰度分析。将膜与切好的带有目的条带的分离胶切下后放入转膜液转膜1～2 h。封闭：用TBST配制的5%脱脂奶粉将PVDF膜封闭2 h。加一抗、二抗：添加Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK、p65、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，5 min/次；将PVDF膜放入二抗，稀释浓度为1∶5000，室温孵育2～3 h，TBST洗膜3次，10 min/次。洗膜后加入ECL发光液，室温反应1 min，凝胶成像仪成像，用天能GIS机箱控制软件V 2.0对条带进行曝光扫描，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量以目的蛋白积分光密度值(IOD)/内参积分光密度值比值表示。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织形态学变化 见表1(图1)。图1中绿色箭头为纤维组织。与假手术组比较，模型组大鼠各心肌细胞间距明显增宽，心肌纤维排列明显紊乱，有大量胶原纤维蛋白沉积，心脏纤维组织表达面积升高；与模型组比较，中药组各心肌细胞间隙缩窄，排列较整齐致密，大鼠心肌组织中仅见少量胶原纤维蛋白沉积。与假手术组比较，模型组心脏纤维组织表达较大，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药组心脏纤维组织表达面积较小，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠心脏纤维组织表达面积比较

图1 各组大鼠心肌组织病理学形态(Masson染色，×400)

2.2 各组大鼠心肌组织Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达比较 各组大鼠在接受药物等干预后进行Western blot法检测，从检测结果来看，与假手术组大鼠心肌组织比较，模型组大鼠心脏组织Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK、NF-κB p65蛋白表达较高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组大鼠组织相比，中药组大鼠心脏中Collagen 1、Collagen 3、NF-κB p65蛋白表达较低，差异有统计学意义(均P<0.05)。中药组大鼠心脏组织p38MAPK蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2(图2)。

图2 各组大鼠心肌组织蛋白电泳图

表2 各组大鼠心肌组织Collagen 1、Collagen 3、p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达比较

3 讨 论

心力衰竭是高血压病常见的并发症之一，长期血压升高造成心脏后负荷过重，神经内分泌因子被过度激活，心肌细胞结构改变，超过代偿范围后，受损组织内部及周围纤维结缔组织增加，最终发展为心肌纤维化，心肌纤维化严重损害心脏功能，治疗难度大，且愈后极差，故探索高血压心肌纤维化的发生机制，延缓纤维化进程对高血压患者的治疗起到了积极作用[6]。目前普遍认为，心肌纤维化作用机制与细胞因子、细胞外机制动态平衡、炎症反应等有关[7]。其中炎症是高血压心肌纤维化发展过程中的重要表现。本研究采用腹主动脉缩窄术构建心衰大鼠模型，通过对比中药组及模型组心肌细胞Masson染色结果及Collagen 1、Collagen 3蛋白表达水平，证实益心附葶饮对大鼠压力性负荷导致的心肌纤维化有抑制作用。进一步测定通过炎症反应影响心肌纤维化的p38MAPK/NF-κB p65信号通路发现，益心附葶饮可抑制该通路相关蛋白，由此认为该方抑制心肌纤维化作用可能与抑制p38MAPK/NF-κB p65信号通路有关。

在心肌纤维化的发生发展过程中，心肌内胶原蛋白发挥着重要作用。心肌细胞可合成多种胶原蛋白，主要为1型和3型胶原蛋白，在健康心脏中分别约占80%、10%，两者合成与降解保持着动态平衡，其中1型胶原蛋白与心肌收缩和舒张的僵硬度有关，抗牵拉能力强，维持心肌壁的拉伸；3型胶原蛋白主要与心肌弹性相关，伸展性较大[8]。在机体正常情况下，心肌细胞合成1型和3型胶原蛋白的含量较低，而在心肌纤维化时则会被过度激活，表现为胶原蛋白大量沉积、Collagen 1与Collagen 3比例失调及胶原空间结构排列紊乱等，进而心肌僵硬，心室顺应性减弱，最终导致心力衰竭的发生。

炎症是心肌纤维化的重要诱发因素，当心脏出现急慢性损伤时，免疫系统被过度激活，炎症信号因子即刻增加，激活心肌成纤维细胞，诱导胶原代谢异常，引起心肌纤维化等病理改变[9]。p38MAPK/NF-κB p65信号通路与炎症反应密切相关，被认为是细胞信号传递的共同通路，在心肌纤维化等疾病发展过程中扮演着重要角色。p38MAPK丝裂原活化蛋白激酶又称为细胞外信号调节激酶，最初由小鼠肝脏细胞中分离纯化提取，是MAPK信号通路的重要蛋白，对促进心肌细胞的增长和发育起着重要作用，其可在生理性应激、紫外线照射、电离辐射等多种细胞外刺激下由非活化状态转为磷酸化，形成p-p38后激活p38信号通路，进而调控体内炎症因子和氧化应激损伤，参与细胞纤维化的病理过程[10-12]。有研究表明，黄葵胶囊能够通过降低p38MAPK信号通路活性以及致纤维化细胞因子、炎症因子蛋白的表达水平而改善肾纤维化[13]。段云娇等[14]总结发现，当发生心肌细胞损伤，降低p38浓度水平能够有效控制心肌细胞炎症反应发展为心肌重构。NF-κB是关键的核转录因子蛋白家族，最初是由淋巴B细胞发现提取，正常情况下以非活化状态的二聚体形式存在，研究发现其具有诱导机体炎症反应和血管内皮损伤的不良作用。NF-κB具有多个亚单位，其中NF-κB p65是NF-κB蛋白家族的明星成员，在不利因素的刺激下，NF-κB从稳定的三聚体状态降解分离，NF-κB得以活化转核，导致多种炎症因子和介质表达，在慢性炎症的调节过程起着举足轻重的作用[15-16]。慢性炎症可直接或间接地为心肌细胞坏死凋亡、心肌纤维化创造条件[17]。有大量实验证明，NF-κB通路与炎症反应及多种疾病的发生发展密切相关。张栋等[18]建立膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)大鼠模型研究KOA发病机制，结果表明NF-κB信号通路在KOA滑膜炎症进展过程中被激活，发挥着重要调控作用。杨家耀等[19]通过构建非酒精性脂肪肝大鼠模型发现，附子理中汤通过抑制NF-κB p65通路降低炎症因子的释放，从而改善肝细胞纤维化，恢复肝功能。

中医古籍中很早就出现了CHF症状、病因病机等记载，但无CHF病名，根据其临床症状(胸闷气短、心慌、乏力、水肿等)可将其归属于“胸痹”“心悸”等范畴，对此历代医家还有“心胀”“水肿”“心水”“喘咳”等记载，其病因病机特点为本虚标实，以脏器亏虚为本，痰浊、水饮、血瘀为标，益气温阳，活血利水为其治疗大法[20-22]。《杂病源流犀烛·怔忡源流》说：“怔忡……或由阳气内虚，或由阴虚内耗”,指出心阳(气)虚是心衰的基本病理改变，贯穿于心衰病程的始终。气虚日久，血液运行无力发为血瘀；心阳虚衰，失于温煦，水饮内停聚而成痰,瘀血、痰浊形成后,进一步损伤阳气,加重心衰。益心附葶饮是雷瑗琳主任医师治疗慢性心力衰竭的经验方，此方阴阳并补，活血利水，经长期临床应用，疗效较好。方中附子、葶苈子为君药，附子温肾通阳，葶苈子泻肺利水平喘；白术、太子参、桂枝相配益气健脾，补益心肾，振奋心阳；佐以茯苓皮健脾利湿，川芎、丹参行气活血化瘀，五味子、生地黄养阴生津；加以甘草调和诸药。全方配伍精当,以补为主,攻补兼施,共奏温阳化气利水之功，患者阳气来复，气化正常，水饮瘀血皆可消。

本实验研究证实，p38MAPK/NF-κB p65炎症反应通路参与了心衰形成病理过程；益心附葶饮能够降低心肌纤维组织表达面积，降低心肌组织中Collagen 1、Collagen 3、NF-κB p65蛋白表达含量，抑制其异常过量沉积，发挥治疗心肌纤维化的作用。p38MAPK蛋白表达在中药组与模型组比较差异无统计学意义，可能与实验例数较少和周期较短等因素有关，有待增加实验例数进一步研究。下一步研究将利用网络药理学对益心附葶饮中的有效中药进行筛选，丰富该方的药理学研究证据。

综上，益心附葶饮通过下调Collagen 1、Collagen 3蛋白表达和抑制NF-κB p65信号通路介导的炎症反应，抑制压力性心力衰竭大鼠心肌纤维化。