针刺调控p38MAPK/NF-κB信号通路对脑卒中后抑郁症大鼠干预机制

冷 凤，史 玲，刘丽莉

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.威海市中医院，山东 威海 264200)

脑卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)主要临床表现为焦虑、乏力、睡眠障碍等，是脑卒中后常见的情感障碍综合征。流行病学调查显示，近30%的脑卒中患者并发抑郁症[1]。目前，PSD发病机制仍不明确，研究显示PSD发病与免疫调节异常相关[2-3]。研究指出，PSD发病时，患者体内常会出现炎症因子异常表达现象，而p38MAPK/NF-κB能够抑制炎症因子释放，调控细胞损伤并干预PSD发病，但具体机制不明[4-5]。中医学将PSD归属于“中风”“情志病”“郁症”等范畴。中风患者主要表现为气血不和，中气逆乱，气机郁滞，阴阳失和，形成湿痰、血瘀等病理产物痹阻脉络，上扰脑窍。针刺作为中医学常用治疗手段，在治疗脑卒中后抑郁中具有适应范围广、不良反应少、方便快捷等优点。多项研究表明，针刺能够改善PAD大鼠的记忆学习功能，调控组织内多种免疫因子释放，干预细胞凋亡，但针刺是否通过调控p38MAPK/NF-κB信号通路影响PSD发病则鲜有报道[6-7]。本实验研究通过建立PSD大鼠模型，并对成功造模的大鼠予针刺干预，刺激百会、大椎、内关、太冲穴，观察脑组织变化，旨在探究针刺对PSD大鼠p38MAPK/NF-κB信号通路的影响，并分析其对细胞损伤的保护机制及对炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：48只SPF级雄性Wistar大鼠购自山东中医药大学动物实验中心，动物生产证号SCXK(鲁)2020-0001，3月龄，平均体重(200±20)g，适应性喂养1周后造模。本实验研究经山东中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.1.2 实验试剂及仪器：本次实验中涉及的主要实验试剂、仪器有盐酸氟西汀分散片(规格20 mg/片，批号J20200002)；水合氯醛(天津大茂化学试剂厂)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)。纤毛机械刺激针(美国Stoelting Co公司)，HANS-200A电针仪(南京济生生物科技公司)，酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)；荧光显微镜(德国徕卡公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、建模及干预：按随机数字表法将48只大鼠分为空白组、模型组、氟西汀组及针刺组，每组12只。除空白组外，其他三组大鼠均按照文献[8]采用KoiZumi法建立PSD大鼠模型。具体方法如下：7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，正颈部偏右侧备皮，分离颈部肌肉后暴露大鼠气管，从气管右下侧动脉处分离颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，手术线结扎固定后缝合消毒。术后24 h测定神经功能缺损评分，取评分1～3分的大鼠进行慢性不可预见性温和刺激(CUMS)+单笼孤养法建立PSD大鼠模型。本次实验36只大鼠均成功造模。氟西汀组大鼠予2.33 mg/(kg·d)氟西汀溶液灌胃；空白组和模型组大鼠予等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d；针刺组将大鼠置于自制鼠袋并固定大鼠，参照《实验针灸学》[9]，将毫针刺入百会、大椎、内关、太冲穴后，接电针仪，刺激强度2 mA，疏密波，2 Hz/100 Hz，15 min/次，1次/d，共治疗14 d。

1.2.2 ELISA法检测免疫因子指标：大鼠心脏取血2 ml，置于离心半径10 cm的离心机内，2500 r/min，离心15 min，取上清液，ELISA法检测各组大鼠血清5-羟色胺(5-Hydroxyteyptamine,5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-Hydroxyindole acetic acid, 5-HIAA)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、肿瘤坏死因子受体相关分子6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)、白介素-1β受体(Interleukin-1 β receptor，IL-1βR)水平。

1.2.3 HE染色检测海马组织病理形态：取各组大鼠部分海马组织，多聚甲醛固定，脱水，制作石蜡切片，脱蜡、染色，盐酸酒精分化后氨水返蓝再使用0.5%伊红液染色，常规脱水，应用二甲苯透明后树胶封片，显微镜下观察海马组织细胞损伤情况。

1.2.4 TUNEL法检测海马组织细胞凋亡：取各组大鼠海马部分组织置于4%多聚甲醛溶液内浸泡24 h，乙醇脱水后切片，脱蜡再置于苏木精中进行染色及脱水透明，TUNEL试剂盒检测各组大鼠海马组织细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot法检测海马组织NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表达：取各组大鼠部分海马组织，加入RIPA裂解缓冲液放置冰上30 min，提取海马组织总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒检测各组海马组织蛋白质浓度。SDS-PAGE将蛋白等量分离后移至PDVF膜上，4 ℃添加一抗与二抗，常温下孵育后ECL试剂显影并分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠免疫因子指标比较 见表1。与空白组大鼠比较，模型组大鼠血清TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平升高，5-HT、5-HIAA水平降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。干预后，与模型组大鼠比较，氟西汀组、针刺组大鼠TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平较低，而5-HT、5-HIAA水平均高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠免疫因子指标比较(μg/L)

2.2 各组大鼠海马组织病理形态比较 HE染色结果提示，空白组大鼠海马组织细胞形态完整，结构清晰，排列整齐；模型组大鼠海马组织细胞核萎缩，染色变深，细胞形态呈不规则变化，排列不整齐；氟西汀组及针刺组大鼠海马组织细胞核趋向完整，萎缩减轻，多数细胞形态规则且整齐(图1)。

图1 各组大鼠海马组织病理形态(HE染色，×200)

2.3 各组大鼠海马组织细胞凋亡情况比较 TUNEL染色中蓝色荧光为正常细胞核，绿色荧光为细胞凋亡情况。激光共聚焦显示，空白组大鼠海马组织正常，绿色荧光极少；模型组大鼠造模后绿色荧光增多。干预治疗后，氟西汀组及针刺组大鼠海马组织细胞绿色荧光减少，提示细胞凋亡情况明显减轻(图2)。

图2 各组大鼠海马组织细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)

2.4 各组大鼠海马组织中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表达量比较 见表2。与空白组比较，模型组大鼠海马组织中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表达量均高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，干预后，氟西汀组和针刺组大鼠海马组织中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表达量均低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠海马组织中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表达量比较

3 讨 论

中医认为，PSD的辨证论治应从脑、肝、肾等脏腑入手。《内经》指出：肝主情志，肝失疏泄，则情志失养，久之则肝气郁结，痰瘀互结阻塞脑窍；肾藏精，主纳气，肾气不足，无法生精化髓，脑失充养，则神明失用，从而导致卒中后抑郁发生，表现为情志低落，记忆下降，神情呆滞，说明卒中后抑郁的发生与正气不足，肝肾失养等有关。《景岳全书》中有“郁证”一说：“内伤积损，颓败而然……若忧郁病者则属大虚，本无邪实”认为内伤情志导致抑郁，辨证本病时多从脑、肝、肾等入手。《医林改错》中王清任认为：“元气虚，则不能达于血管，血管无气，必停留而生瘀”治疗该病时应以益气活血为主。研究指出，针刺能有效改善睡眠障碍，减少抑郁情绪，但具体机制尚不明确[10]。《灵枢·海论》曰：“夫十二经脉者，内属于脏腑，外络于肢节。”经络系统的调和、通畅是人体气血正常运行的基础。针刺作为一种非药物的疗法，标本兼顾，气血同治，调和阴阳，是多层次、多通道、多靶点的综合治疗，具有疏通经络，调和气血，平衡阴阳的作用。针刺穴位可供气进入、传出、交汇和聚积，临床上治疗神志病常选用“百会穴”“大椎穴”“内关穴”“太冲穴”等，且这些穴位在抑郁症的治疗中应用较多。现代研究指出，针刺治疗可有效改变中枢神经递质的传递，干预外周迷走神经，从而有效改善组织内免疫细胞表达，提高机体免疫力；而且针刺能够调节嗜酸性粒细胞释放组胺酶，缓解免疫细胞过度表达对细胞的损伤[11-12]。肖伟等[13]采用针刺百会穴联合安神解郁汤治疗脑卒中后抑郁，结果表明这种治疗方案能够明显改善患者症状，提高日常生活能力及改善神经功能缺损程度。韩振翔等[14]研究认为，电针刺激大鼠“百会穴”“大椎穴”能显著改善脑卒中后抑郁模型大鼠脑神经细胞γ-氨基丁酸、血管内皮生长因子表达，改善脑卒中后抑郁模型大鼠抑郁症状。Wang等[15]研究认为，电针太冲穴等能够明显改善脑卒中后抑郁模型大鼠的行为学指标，影响神经元的生存、发育及功能，且能够调节海马神经脑源性神经营养因子以及蛋白激酶类家族B蛋白的表达。

大脑皮质与人的情绪变化密切相关，是大脑重要的情感中枢。海马区是大脑皮质的一个内褶区，抑郁症患者以海马区为主的边缘结构可发生神经减退、体积萎缩等病理现象[13]。PSD发病过程中免疫因子代谢异常起关键作用，而脑神经元和机体神经-内分泌-免疫调节网络与免疫因子分泌密切相关[14-15]。5-HT活性改变参与抑郁症的发病，免疫细胞因子水平升高可引起大脑内吲哚胺-2，3-双加氧酶升高，导致海马组织内5-HT水平下降，从而诱发抑郁症。免疫改变在PSD发病过程中发挥重要作用，是修复受损海马组织以保护中枢神经系统的主要生理反应，而p38MAPK/NF-κB信号通路是炎症反应的重要信号通路之一[16]。p38MAPK是一类分化上保守的蛋白因子，参与调控基因表达，代谢活动以及细胞凋亡和分化活动[17]。NF-κB是细胞内信号转导的重要因子，其参与机体多种细胞凋亡的防御和保护过程，NF-κB二聚体通过暴露出核定位序列，进而与目的基因发生特异性结合，触发组织氧化应激，活化炎症因子及炎症反应，参与大脑、间脑、小脑和脑干的病理生理过程，成为各种脑部疾病的致病媒介[18-19]。非磷酸化状态的p38无活性，当被各种应激因素或炎症因子刺激时，p38结合到MAPK/NF-κB信号通路释放的信号因子，激活相应炎症通路。NF-κB p65及p38MAPK活化过程能够结合促凋亡蛋白以及炎症受体蛋白等多种炎症反应底物，通过调控特异性细胞因子及转录因子表达，诱导组织中细胞分化与凋亡，诱发炎症反应，减缓细胞损伤进程[20-22]。

本实验发现，造模后PSD模型组大鼠血清TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平升高，5-HT、5-HIAA水平降低，表明造模后PSD大鼠血清炎症因子发生改变，这与PSD发病机制吻合。与模型组大鼠比较，氟西汀组、针刺组大鼠5-HT、5-HIAA、TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平在治疗干预后均改善，这与既往研究结果一致[23-24]。本研究结果提示，针刺干预治疗能够有效调节PSD大鼠p38MAPK/NF-κB信号通路表达，干预PSD大鼠体内细胞凋亡及炎症因子表达。