电针对颅脑损伤大鼠脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白的影响

张容超，吴 涛，刘 奇，李 娜，郭奎奎，杜 旭，王瑞辉

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是一种常见的神经外科疾病，属中医学“跌仆”“脑伤”范畴[1]。TBI主要是由暴力直接或间接作用于头部，破坏正常脑实质而发病，常可引起暂时或永久性的认知、心理及生理功能的丧失，其发病率居全身创伤性疾病之首，患者群体主要是青壮年男性[2]。不管是在贫穷战乱地区，还是发达和平的国家TBI的发病率都非常高，本病引起的学习、工作等日常生活能力的障碍及巨额的医疗费用，给患者及社会带来了沉重的负担，近年来随着工矿、交通等基建行业的发展，其发病率不断上升。研究发现，针灸治疗可减轻TBI的继发性损害，改善患者预后，具有独特的疗效。前期研究发现电针对TBI大鼠的疗效较佳，且常选腧穴为百会、水沟、曲池、内关、足三里、涌泉[3-4]，本研究以TBI模型大鼠为研究对象，以电针为干预手段，通过检测TBI大鼠损伤脑组织PI3K/AKT通路关键蛋白的表达量，探讨电针对TBI大鼠的治疗效应及作用机制，为针灸治疗TBI的科研和临床研究提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选用SPF级雄性SD大鼠160只，购自四川成都达硕实验动物有限公司[批号SCXK(川)2015-030]，平均体重(200±20)g。实验严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》[5]。饲养环境12 h明暗交替、恒温恒湿，自由饮水、普通饮食常规适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2 主要实验试剂与仪器：戊巴比妥钠(批号096956-001)，Anti-PI3K p85α mouse IgG antibody(批号sc-374534)，Anti-AKT1/2/3 rabbit IgG antibody(批号BM4400)，HRP-Goat anti-rabbit IgG(H+L)(批号HS101-01)，HRP-Goat anti-mouse IgG(H+L)(批号HS201-01)，抗荧光衰减封片剂(批号P0126)，脑立体定位仪(ST-3ND型)，4 ℃低温离心机(5804型)，恒温水浴锅(HH420型)，生物组织全自动脱水机(YD-12P2型)，华佗牌无菌针灸针(0.32 mm×15 mm)，DM6000电动多功能直立荧光显微镜(德国Leica公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模及分组：将160只大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、电针组、电针加阻断组、阻断剂组，除空白组外，其余每组30只。大鼠禁食禁水6 h后造模，腹腔注射80 mg/kg的1%戊巴比妥钠麻醉，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，剃毛、消毒、切开皮肤、剥离骨膜，暴露左侧顶骨，用微型磨钻在冠状缝后3 mm、失状缝左侧旁约2.5 mm处钻一骨窗(r≈2 mm)，用改良Feeney自由落体撞击法创伤脑实质[6]，脑创伤后止血，创口处滴注硫酸庆大霉素注射液5滴预防感染，缝合头皮，回笼[7]。模型组、电针组按以上方法造模，空白组不做处理，假手术组大鼠仅颅骨钻孔，不损伤脑实质，阻断剂组、电针加阻断组通过药物进行PI3K/AKT通路阻断，参照张慧、Endo等[8-9]研究方法，在造模过程开颅形成骨窗后，用微量注射器自脑组织表面垂直进针，进针深度约2.5 mm，缓慢注入10 μl阻断剂(DMSO溶液稀释的LY294002溶液，浓度为10 μmol/L)，注射时间约5 min，缓慢退针，阻断剂注射完成3 min后，再行自由落体撞击法制造TBI大鼠模型；电针组、模型组同法注入等量DMSO溶液；其余各组不做处理；阻断剂组及电针加阻断组大鼠在每次电针前尾静脉注射LY294002稀释液10 μl[10-12]。造模后以改良神经功能缺损评分[13]评定大鼠即刻神经功能，7～12分为模型制备成功。

1.2.2 干预方法：空白组、假手术组、模型组正常饲养，不予电针干预。电针组、电针加阻断组于造模后24 h予电针，参照中国针灸学会实验针灸学分会制定的《常用实验动物穴位定位图谱》及《大鼠穴位图谱的研制》[14]定位，取大鼠百会、水沟及右侧足三里、涌泉、内关、曲池穴针刺，常规消毒后，用一次性针灸针(规格0.32 mm×15 mm)向后平刺百会约3 mm、向上平刺水沟3 mm，曲池、内关、足三里、涌泉均直刺约3 mm，各穴进针后均匀捻转行针3～5次，接电针仪(华佗牌SDZ-Ⅱ型)，曲池、内关穴接一组电极，足三里、涌泉穴接另一组电极，断续波，频率2 Hz，强度1 mA，时间15 min，1次/d，共14 d。

1.2.3 免疫荧光法检测大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达：除空白组外，各组大鼠电针后3、7、14 d取材并采用免疫荧光法检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K、AKT蛋白的表达，空白组在造模后14 d取材检测。取材：麻醉成功后常规左心室冰0.9%氯化钠溶液灌注、断头并于冰上取损伤脑组织，常规4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋及切片备用。免疫荧光检测：由柠檬酸三钠3 g加柠檬酸0.4 g加双纯水1000 ml配制抗原修复液，常规烤片、脱蜡、抗原修复，PBS溶液以1∶10比例稀释浓缩型血清封闭液封闭，37 ℃孵育，孵一抗，4 ℃过夜，复温后，PBST溶液洗涤10 min，2次，PBS溶液洗涤5 min，4次，孵二抗，37 ℃温育，PBST溶液洗涤5 min，2次，PBS溶液洗涤5 min，4次，滴加PBS稀释的SABC-FITC溶液(1∶100)，37 ℃温育，PBST溶液洗涤5 min，2次，PBS溶液洗涤5 min，4次，避光，用DAPI染色液对细胞核轻度复染，37 ℃温育，PBST溶液洗涤5 min，2次，PBS溶液洗涤5 min，4次，抗荧光衰减封片剂封片，最后在荧光显微镜下观察并摄片，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对免疫荧光(IF)图像进行处理，统计目标蛋白的表达量，PI3K、AKT蛋白表达水平以荧光图像中阳性反应着色点的IF-OD值表示。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织PI3K相对表达量比较 见表1。电针后3、7、14 d，假手术组与空白组PI3K表达比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。模型组PI3K表达低于假手术组，高于阻断剂组，差异有统计学意义(均P<0.05)。电针后3 d，电针组PI3K表达与模型组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。电针后7、14 d，电针组PI3K表达均高于模型组，差异有统计学意义(均P<0.01)。电针后3、7、14 d，电针组PI3K表达均高于电针加阻断组，差异有统计学意义(P<0.01)。阻断剂组PI3K表达与电针加阻断组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠脑组织PI3K相对表达量比较

2.2 各组大鼠脑组织AKT相对表达量比较 见表2。电针后14 d，假手术组与空白组AKT表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组各时间点AKT表达低于假手术组，高于阻断剂组，差异有统计学意义(均P<0.05)。电针后3 d，电针组AKT表达与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；电针后7、14 d，电针组AKT表达均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。电针后3、7、14 d，电针组AKT表达均高于电针加阻断组，差异有统计学意义(均P<0.01)。阻断剂组AKT表达与电针加阻断组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组大鼠脑组织AKT相对表达量比较

3 讨 论

《内经》中关于脑损伤的相关记载：“有所击堕，恶血留内”，TBI后，因跌仆损伤导致气血逆乱及气血瘀阻，进而蒙蔽清阳、升降失司、痰湿内生，瘀血与痰湿阻滞经络。脑为“髓海”“元神之府”“诸阳之会”，若瘀血阻滞脑络，则可引起升降失调，五脏六腑之精气不得上升，髓海失养而空虚，出现头晕、面色苍白、烦躁不安、神昏等症。TBI后的治疗在急性期以急救、最大限度地保住患者生命为主，而康复期的治疗重点是对TBI引起的神经、认知、肢体运动功能障碍等后遗症的治疗[15-16]。脑损伤与气滞、气虚、血瘀阻滞脑络导致髓海失养、气机逆乱关系密切。“气”和“血”是相互依存、相互滋生的，颅脑受外伤后必然引起脑部出血，甚至全身多部位出血，那么就会出现“气随血脱”之“脉微欲绝，大汗淋漓，面色苍白”等重症，此时TBI的救治主要以补血益气固脱为主。随着病程的推进，颅脑损伤的康复期患者会出现气虚血瘀或气滞血瘀之“头痛、头晕、恶心、神志不清、言语不清、偏瘫”等症，此时的治疗以疏通经络，益气活血，化瘀止痛为主。TBI后会引起脑组织出血、水肿、脑血管痉挛，进而出现脑循环障碍，然而TBI后脑神经细胞的生理病理变化较为复杂，包括神经递质的释放、氧自由基的产生、钙调节机制的损伤、线粒体功能的障碍、炎症反应及细胞坏死凋亡等。随着外科急救水平的更新和提高，TBI的病死率大幅下降，但是患者的致残率却在逐渐增加，TBI患者康复期出现的精神障碍、肢体运动功能障碍、自主神经功能紊乱等各种并发症非常棘手，为探索本病的优势治疗方案意义重大。

针灸疗法“简、便、廉、验”，尤其是刺激量可控的电针，可疏通经络、活血化瘀、调整阴阳、醒神开窍，在治疗TBI等神经系统疾病方面优势明显。研究发现，电针可调节细胞内的自噬及凋亡从而减轻脑组织缺血再灌注损伤，刺激与神经生长相关的生长因子EGF、bFGF的表达，促进神经干细胞的增殖与分化并缩小颅脑损伤的面积[17-20]。此外，在TBI早期介入针灸可以抑制炎症反应，减少细胞凋亡，促进TBI大鼠脑神经功能的康复[21-22]。研究表明，成年大鼠脑组织AKT微量表达，TBI后1 h内p-AKT表达开始增加，在损伤皮质边缘区其免疫反应性增强，全脑组织中p-AKT区域表达的差异可能导致细胞损伤程度的不同，PI3K/AKT信号通路参与调控TBI的病理过程，p-AKT的表达量与脑损伤程度有关[23]。本研究选用治疗TBI的优选腧穴百会、水沟、曲池、内关、足三里、涌泉，百会、水沟属督脉醒脑开窍、回阳救逆，曲池、内关可疏调经络、活血通脉，足三里、涌泉补益气血、沟通阴阳，诸穴共奏通经活络、调和阴阳、醒脑开窍之功，促进脑损伤的康复[24]。本研究结果显示，电针治疗后7、14 d电针组PI3K、AKT表达量高于模型组、阻断剂组，提示电针可促进TBI大鼠损伤脑组织中PI3K、AKT蛋白表达。PI3K/AKT信号通路在调节细胞存活中起至关重要的作用，蛋白激酶B磷酸化后可以激活Bad和Forkhead等一系列下游靶蛋白抑制细胞凋亡，上调细胞存活率[25]。本研究从PI3K/AKT通路关键蛋白PI3K、AKT角度对电针治疗TBI模型大鼠的效应进行实验，探索了电针治疗TBI大鼠的效应机制，为TBI的实验研究提供思路。然而，本研究仅探索了通路的关键蛋白，下一步将以本实验为基础深入研究，探索针灸治疗脑损伤的效应机制。