紫草素通过抑制上皮间质转化缓解结肠癌细胞5-氟尿嘧啶耐药

徐建立，孙艳华，李 明，董 路，孟小晶

(沧州市人民医院，河北 沧州 061001)

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，严重威胁患者的身心健康[1]。结肠癌早期没有明显症状，中晚期才逐渐出现腹胀、消化不良、腹痛、黏液便或黏血便等症状[2]。因此，结肠癌一经诊断往往是中晚期。目前，结肠癌的临床治疗主要包括传统手术、化疗、放疗以及新兴的靶向治疗和免疫治疗等[3]。新药物的应用以及治疗策略的更新一定程度延长了患者的生存周期，但结肠癌患者经过一段时间治疗后通常会出现获得性耐药，最终导致治疗失败[4]。

中药紫草为紫草科多年生草本植物新疆紫草或内蒙紫草的干燥根，别名紫丹、地血、山紫草等[5]。紫草性味甘、咸、寒，归心、肝经，主要用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等[5]。紫草的化学成分复杂，主要包括萘醌类、苯醌类、苯酚及酚酸类等[6]。现代药理学研究发现，紫草具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、清热、止血、降血糖等广泛的药理作用[6]。萘醌衍生物在紫草中含量较高，其中以紫草素相关研究最为广泛。研究显示，紫草素在多种恶性肿瘤中发挥抗癌作用，如大肠癌、睾丸癌、胰腺癌等[7-9]。但紫草素在结肠癌细胞耐药中的作用尚不清楚。本研究以结肠癌HT-29细胞为研究对象，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouraci，5-FU)诱导耐药细胞HT-29/DR，观察紫草素在HT-29/DR细胞耐药中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞系：人结肠癌HT-29细胞，购自上海生物工程研究所。

1.1.2 实验试剂：5-FU(批号44825，美国MCE公司)；DMEM培养基(批号8120033、2132094P)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(批号SUELN，青岛思科捷公司)；FAK抗体、Src抗体、Fibronectin抗体(批号C2332、C1521、A2521，美国圣克鲁斯公司)；E-cadherin抗体、p-Src抗体、p-FAK抗体、羊抗兔IgG-HRP抗体、羊抗小鼠IgG-HRP(批号15、3、8、28、33，美国CST公司)；GAPDH抗体(批号M29D22，南京巴傲得公司)；PBS、0.1%结晶紫染色液、总蛋白提取试剂盒、MTT试剂盒及RIPA细胞裂解液(北京索莱宝公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)。

1.1.3 实验仪器：全波长酶标仪(型号Multiskan SkyHigh，美国Thermo Scientific公司)；全自动数码凝胶图像分析系统系统(型号Tanon3500，上海天能公司)；倒置显微镜(型号CKX53，日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：采用90%的DMEM、10%胎牛血清、1%青-链霉素制备培养基，培养细胞。实验用细胞培养时置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱。

1.2.2 HT-29/5-FU细胞构建：将HT-29细胞传代至6 cm培养皿中，用起始浓度为0.01 μmol/L的5-FU处理细胞直至生长稳定。传代2～3次，提高5-FU浓度(每次提高0.01 μmol/L)处理HT-29细胞直至生长稳定。继续传代2～3次，按上述操作提高5-FU浓度直至4.5 μmol/L，当细胞稳定生长后进行后续实验。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：将生长至对数期的HT-29/5-FU、HT-29细胞接种于96孔板，每孔8000个细胞左右。按照需要加入适量紫草素处理24 h，必要时加入0～200 μmol/L 5-FU继续处理24 h。处理结束后每孔加入100 μl的MTT于培养箱孵育4 h。取出细胞，弃去培养液，加入浓度为150 μl的DMSO，于酶标仪检测OD值。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞克隆能力：将HT-29和HT-29/5-FU细胞以每孔300个传代至6孔板中，置于培养箱培养过夜。次日，各加入含5 μmol/L5-FU的培养基继续培养12 d。弃去旧培养基，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗2遍，加入0.1%结晶紫染色液静置10 min，清水洗2遍。用相机拍照记录。

1.2.5 蛋白印迹实验检测p-Src、p-FAK、E-cadherin和Fibronectin蛋白表达：将处理好的细胞收集于5 ml离心管，1000 r/min离心5 min，弃去上清液后加入1 ml的PBS重悬。将细胞转移至1 ml的EP管，1000 r/min离心5 min，弃去废液。将细胞置于冰上，加入RIPA细胞裂解液裂解10 min，12000 r/min离心20 min，上清液即为总蛋白。取2 μl总蛋白以BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，而后以蛋白上样缓冲液制备蛋白浓度为2.5 μg/μl的蛋白样品，100 ℃变性5 min。变性好的蛋白样品以10%的SDS-PAGE电泳进行分离，随后转印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封闭2 h，用p-Src(1∶1000)、Src(1∶2000)、FAK(1∶1000)、p-FAK(1∶500)、Fibronectin(1∶500)、E-cadherin(1∶2000)或GAPDH(1∶1000)抗体于4 ℃摇床孵育过夜，次日TBST洗3遍，孵育羊抗兔/鼠IgG-HRP二抗，TBST洗3遍，PVDF膜淋ECL化学发光液显色，置于凝胶成像仪下显影，读取相应蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1 5-FU耐药HT-29细胞验证 采用直接增加5-FU浓度，梯度诱导的方法成功构建5-FU耐药结肠癌细胞HT-29/5-FU，5-FU处理后HT-29和HT-29/5-FU细胞存活率，见表1。经计算，HT-29/5-FU耐药指数为6.5。克隆形成实验结果显示，5-FU处理后HT-29细胞克隆形成率为100%，HT-29/5-FU细胞为(382.6±36.1)%；与HT-29细胞比较，HT-29/5-FU细胞克隆形成率较高，两种细胞的克隆形成率比较，差异有统计学意义(P<0.01)，提示HT-29/5-FU构建成功(图1)。

表1 不同浓度5-FU对HT-29和HT-29/5-FU细胞存活率影响

图1 5-FU对HT-29、HT-29/5-FU细胞克隆形成的影响

2.2 紫草素对HT-29/5-FU、HT-29细胞增殖的影响 MTT结果(图2)显示，紫草素处理后HT-29/5-FU和HT-29细胞的存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。0.05～1 μmol/L紫草素对HT-29/5-FU和HT-29细胞存活率的影响与溶剂对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)；5 μmol/L紫草素组、10 μmol/L紫草素组均可降低两种细胞的存活率，与溶剂对照组比较，差异有统计学意义(均P<0.01)。为排除紫草素对细胞增殖的影响，采用0.1、0.5、1 μmol/L紫草素进行后续研究。

注：与溶剂对照组比较，*P<0.01

2.3 紫草素对HT-29/5-FU细胞5-FU耐药的影响 MTT结果(图3)显示，5-FU对溶剂对照组、0.1 μmol/L紫草素组、0.5 μmol/L紫草素组、1 μmol/L紫草素组HT-29/5-FU细胞的IC50分别为(112.8±12.3)、(91.4±10.6)、(51.2±5.5)、(26.6±3.1)μmol/L。与溶剂对照组比较，0.5 μmol/L紫草素组和1 μmol/L紫草素组的IC50水平均低，差异有统计学意义(P<0.01)。提示紫草素能缓解HT-29/5-FU细胞对5-FU耐药。

注：与溶剂对照组比较，*P<0.01

2.4 各组HT-29/5-FU细胞Src和FAK磷酸化蛋白表达比较 见表2(图4)。蛋白印迹结果显示，与溶剂对照组比较，0.5 μmol/L紫草素组、1 μmol/L紫草素组的HT-29/5-FU细胞p-Src和p-FAK蛋白表达均低，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组HT-29/5-FU细胞Src和FAK磷酸化蛋白表达比较(%)

图4 各组HT-29/5-FU细胞Src和FAK磷酸化蛋白表达电泳图

2.5 各组HT-29/5-FU细胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表达比较 见表3(图5)。蛋白印迹结果显示，与溶剂对照组比较，0.5 μmol/L紫草素组、1 μmol/L紫草素组HT-29/5-FU细胞E-cadherin蛋白表达均高，Fibronectin蛋白表达均低，组间两两比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组HT-29/5-FU细胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表达比较(%)

图5 各组HT-29/5-FU细胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表达电泳图

3 讨 论

中药是中医体系的重要组成部分[10]。相对于西药，中药的化合物组成成分多样，难以解释其具体作用机制[11]。从中药中提取的单体化合物具有明确的化学结构式，较易研究单体化合物发挥药效的潜在作用机制。因此，深入研究中药单体化合物的作用机制，有利于丰富中药的理论体系，为中医治疗提供相关理论基础。大量研究显示，一些中药单体化合物在抵抗肿瘤对化疗药物耐药方面具有积极作用。中药三七的活性成分三七总皂苷具有活血祛瘀，通脉活络的功效。冯晓异等[12]研究发现，三七总皂苷在逆转肝癌细胞对阿霉素耐药方面发挥一定作用，其可通过抑制细胞外信号调节激酶/蛋白激酶B信号通路介导多药耐药基因1表达下调,进而提高阿霉素在耐药细胞中累积。榄香烯是从重要莪术中提取分离的倍半萜烯类化合物。研究显示，榄香烯参与肺癌细胞顺铂耐药，其可诱导顺铂耐药的SPC-A-1细胞自噬，从而介导耐药细胞对顺铂的敏感性增强[13]。槲皮素作为广泛分布于多种中草药中的黄酮醇类化合物，被证实在抑制膀胱癌顺铂耐药中发挥重要作用。翁旭东等[14]研究发现，槲皮素能上调顺铂耐药膀胱癌细胞凋亡调节蛋白Bim的表达水平，Bim通过与Bax蛋白结合诱导细胞色素C释放，从而触发胱天蛋白酶介导的细胞凋亡，最终增强顺铂对膀胱癌细胞的杀伤作用。这些研究表明，研究中药提取物在恶性肿瘤化疗药物耐药中的作用，对于中西医临床治疗具有重要理论价值和指导意义。

中药紫草具有凉血、活血、解毒、清热、透疹的作用，常应用于湿热斑疹、黄疸、热结便秘、丹毒、疮疡、淋病等疾病。历代古籍对紫草功用的记载各有侧重，《本经》：“主心腹邪气，五疸，补中益气，利九窍，通水道。”《别录》：“疗腹肿胀满痛，以合膏，疗小儿疮及面齄。”《本草图经》：“治伤寒时疾，发疮疹不出者，以此作药，使其发出。”《本草纲目》：“紫草，其功长于凉血活血，利大小肠。故痘疹欲出未出，血热毒盛，大便闭涩者宜用之，已出而紫黑便闭者亦可用。若已出而红活，及大陷大便利者，切宜忌之。”《本草经疏》：“紫草为凉血之要药，故主心腹邪热之气。五疸者，湿热在脾胃所成，去湿除热利窍，其疸自愈。邪热在内，能损中气，邪热散即能补中益气矣。苦寒性滑，故利九窍而通水道也。腹肿胀满痛者，湿热解而小便出，则前症自除也。合膏药疗小儿痘疮及面齄，皆凉血之效也。”紫草素是从中药紫草中提取的萘醌衍生物，具有广泛的药理作用。研究显示，紫草素可通过靶向Cdc25s蛋白诱导乳腺癌细胞周期阻滞，进而抑制细胞增殖[15]。另有研究显示，紫草素通过AKT/mTOR和ROS/ERK1/2通路降低基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达，从而抑制前列腺癌细胞转移[16]。最近研究报道显示，紫草素可通过同时抑制ADAM17和IL-6/STAT3信号通路，协同抑制结肠癌细胞生长[17]。以上均提示，紫草素能通过多种信号机制发挥抗癌作用。但紫草素是否在结肠癌细胞化疗耐药中发挥作用尚不清楚。为观察紫草素在结肠癌细胞5-FU耐药中的作用，本研究采用直接增加5-FU药物浓度，梯度诱导的方法构建5-FU耐药结肠癌细胞HT-29/5-FU，耐药指数为6.5。克隆形成实验验证发现，5-FU处理后HT-29/5-FU细胞克隆形成能力明显增强，提示HT-29/5-FU构建成功。本研究首先观察紫草素对HT-29和HT-29/5-FU细胞增殖的影响。结果发现，0.05～1 μmol/L紫草素对HT-29/5-FU和HT-29细胞存活率无明显影响，而1～10 μmol/L紫草素显著抑制两种细胞增殖。为排除紫草素对细胞增殖的影响，采用0.1、0.5、1 μmol/L紫草素进行后续研究。进一步研究发现，5-FU对0.5、1 μmol/L紫草素处理的HT-29/5-FU细胞IC50显著降低，提示紫草素可增强HT-29/5-FU细胞对5-FU的抵抗作用。分子研究发现，0.5、1 μmol/L紫草素可抑制HT-29/5-FU细胞Src和FAK磷酸化蛋白表达。FAK-Src信号通路在恶性肿瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。研究显示，Ⅳ型胶原α1链通过激活FAK-Src信号通路促进肝癌细胞生长和转移[18]。Zhang等[19]研究发现FAK-Src信号通路可介导lncRNA KCNQ1OT1诱导的舌癌细胞增殖和顺铂耐药。研究显示，ASPP2蛋白通过抑制肝癌细胞Src/FAK/Snail信号轴抑制干细胞样特征和化疗药物抗性[20]。以上提示，紫草素可能通过抑制Src-FAK信号通路抑制HT-29/5-FU细胞对5-FU耐药。

上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程[21-22]。在肿瘤细胞中，EMT的发生往往导致细胞恶性生物学行为增强[22]。为了探讨EMT是否参与紫草素抵抗结肠癌细胞5-FU耐药，观察了紫草素对HT-29/5-FU细胞EMT标志物的影响。E-cadherin和Fibronectin蛋白分别为公认的上皮细胞标志物和间质细胞标志物，E-cadherin蛋白表达下调和Fibronectin蛋白表达上调通常提示细胞发生EMT[23]。本研究结果发现，0.5、1 μmol/L紫草素可诱导HT-29/5-FU细胞上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达上调，间质细胞标志物Fibronectin蛋白表达下调，提示紫草素能抑制HT-29/5-FU细胞EMT状态。研究显示，Src-FAK信号通路参与膀胱癌细胞EMT，BSA结合对甲酚硫酸盐通过ROS/Src/FAK信号通路触发膀胱癌细胞迁移和EMT[24]。Src-FAK信号通路参与调节肿瘤细胞EMT从而维持细胞耐药。研究报道，Src-FAK信号通路可介导非小细胞肺癌EMT相关的厄洛替尼耐药[25]。

综上，紫草素可能通过抑制Src-FAK通路抑制上皮间质转化缓解结肠癌细胞5-FU耐药，但紫草素抑制Src-FAK信号通路的具体作用机制需进一步深入研究。值得注意的是肿瘤具有异质性，紫草素是否在其他恶性肿瘤中能够发挥类似作用还不清楚。总之，本研究发现了紫草素抵抗结肠癌细胞5-FU化疗耐药的潜在作用和机制，为临床治疗结肠癌化疗耐药提供了一定的实验支持。