基于RhoA/ROCK信号通路探讨四逆汤对心肌缺血再灌注氧化损伤作用机制

张云波，顾申红，陈菊明，吴华珺

(海南医学院第一附属医院全科医学科，海南 海口 570102)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是目前全球发病率较高的心血管疾病之一。随着血管再通技术的不断发展和普及，AMI整体预后情况较以往得到明显改善，但心肌再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)加重了心肌组织损伤，是AMI死亡的重要原因[1-3]。减轻MIRI、有效保护心肌细胞是目前AMI治疗的重点。四逆汤是我国经典中药方，具有温中祛寒、回阳救逆的功效。刘耀武[4]研究发现，四逆汤联合尿激酶溶栓能有效减轻AMI患者心肌缺血再灌注损伤，且安全性较好。尹翠翠等[5]通过动物实验发现，四逆汤能有效清除自由基，减轻缺血对心肌组织造成的损伤。以上研究均证实，四逆汤能减轻缺血以及MIRI对心肌细胞造成的损伤，发挥心肌保护作用。本研究意在验证四逆汤是否通过抑制人RAS同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member，ARhoA)/Rho激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)信号通路，调控细胞凋亡，减轻心肌组织损伤。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：60只SPF级健康雄性清洁级大鼠购自江苏艾菱菲生物科技有限公司，平均体重(250±10)g，饲养于独立通风系统内，平均温度(22±2)℃，湿度40%～70%，光照节律12L/12D。

1.1.2 实验试剂：RhoA一抗、ROCK1一抗、ROCK2一抗均购自英国Abcam公司(批号bs-1180R、SC-5560、BA0610)，髓过氧化物酶(Myelopexoxidase,MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号20161224、20161217、20160607)，台盼蓝剂购自长沙裕丰化玻器械公司(批号20190715)，BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购自碧云天生物试剂公司(批号20180607、20180524)，Tris购自北京Topbio公司(批号20170513)，鼠单克隆抗体β-Actin、兔抗鼠Bcl-2、兔抗鼠Bax均购自Santa Cruz公司(批号20180709、20181213、20191116)，氟伐他汀胶囊购自瀚晖制药公司(国药准字H20070167)。

1.1.3 实验仪器：小动物呼吸机(型号HX-100E，成都泰盟科技公司)，自动石蜡切片机(型号2050，德国Leica公司)，切片烘干机(型号HI1220，德国Leica公司)，高速冷冻离心机(型号3-18K，德国Sigma公司)，电泳仪(型号PowerPac Basic，美国Bio RAD公司)，凝胶成像分析仪(型号JS-860B，美国GRANT公司)，酶标仪(型号Mutiskan Go，美国Thermo Fisher公司)，紫外线可见光分光光度计(型号WFZ UZ-2000，上海尤尼柯仪器公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 四逆汤：附子10 g，干姜、甘草各6 g，将以上中药加水煎煮并浓缩汤药至浓度4.3 g/ml，4 ℃低温保存。

1.2.2 建模、分组与给药：将60只大鼠随机分为空白对照组、再灌注损伤组、阳性对照组、四逆汤组，每组10只。再灌注损伤组、阳性对照组、四逆汤组采用LAD法建模，空白对照组大鼠只做穿线处理。模型建立成功标志：结扎前，大鼠心电图平稳，结扎缺血30 min与再灌注120 min时，心电图Ⅱ导联ST段有明显抬高，肉眼可见心肌缺血症状，与缺血时段比较，大鼠心电图Ⅱ导联ST段下降>50%。采用LAD结扎法建立MIRI大鼠模型，空白对照组大鼠仅穿线，不结扎冠状动脉，术后0.9%氯化钠溶液10 ml/(kg·d)灌肠2周。再灌注损伤组建模后予0.9%氯化钠溶液10 ml/(kg·d)灌肠2周。四逆汤剂量参照《药理实验方法学》人鼠等剂量换算，按照人体体表面积的0.018倍计算得出药物最佳使用剂量为13 g/(kg·d)，四逆汤组大鼠建模后予四逆汤13 g/(kg·d)灌肠2周。阳性对照组大鼠建模后氟伐他汀用量按照70 kg成人剂量换算，大鼠氟伐他汀1 d用量为4 mg/kg，灌肠2周。

1.2.3 血液酶学指标检测：干预2周后，采集各组大鼠全血3 ml，低温高速离心机1200 r/min，离心10 min，留取血浆，-70 ℃冰箱保存待用。分别检测血浆髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平，按照试剂盒相关步骤进行操作。

1.2.4 TTC染色观察心肌梗死面积：经股静脉注入2 ml的0.6%台盼兰，处死大鼠，取出心脏，去除心脏黏膜与附属结构，去除心耳与右心室，置于-20 ℃冰箱内保存30 min后取出，将心脏制作为1 mm切片，灌注区着蓝色，非灌流区不着色，即缺血危险区(Area at risk,AAR)。分离AAR并将其置于1%的TTC溶液，4%多聚甲醛固定，显微镜下分离AAR中的梗死区(Infarction area,IS)，计算IS与AAR比值(IS/AAR)。

1.2.5 HE染色法观察大鼠心肌组织：4%多聚甲醛固定心尖组织、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡与复水、HE苏木素染色、切片。光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织形态。

1.2.6 免疫印迹法检测RohA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平：研磨大鼠心肌组织，加入Lysis buffer溶液，裂解心肌组织，6953×g将组织匀浆离心10 min，BCA法检测RohA、ROCK1、ROCK2蛋白浓度。SDS-PAGE蛋白电泳，硝酸纤维素膜在转移缓冲液内处理25 min，拆除凝胶夹层，弃浓缩胶，将分离胶浸至转移缓冲液，制作转印夹层并将其放置于电转膜槽内，200 mA恒流电转90～120 min，1×丽春红染色，PBST冲洗，按蛋白分子量大小剪下相应目的条带并将其放入5%脱脂奶粉，摇床室温振荡封闭1 h。硝酸纤维素膜5%封闭液稀释的特异性一抗(RhoA 1∶2000，ROCK1 1∶500，ROCK2 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，Bax 1∶500，β-actin 1∶1000，GAPHD 1∶4000)孵育，4 ℃过夜，硝酸纤维素膜用5%封闭液稀释的山羊抗兔(1∶3000)、山羊抗小鼠(1∶5000)二抗室温孵育2 h，弃二抗，增强化学发光底物反应液与膜孵育3 min，放入X-光片夹内，暗室内压曝光。Quantity One软件扫描，以β-actin为内参，计算RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠血液酶学指标比较 见表1。与空白对照组比较，再灌注损伤组大鼠血浆MPO、MDA水平均升高，血浆SOD水平下降，差异有统计学意义(均P<0.05)。与再灌注损伤组比较，阳性对照组以及四逆汤组大鼠血浆MPO、MDA水平降低，SOD水平上升，且四逆汤组血浆MPO、MDA水平低于阳性对照组，SOD水平高于阳性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 各组大鼠血液酶学指标比较

2.2 各组大鼠心肌梗死范围比较 见表2。阳性对照组、四逆汤组大鼠IS、IS/AAR均低于再灌注损伤组，四逆汤组大鼠IS、IS/AAR水平低于阳性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。三组AAR比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠心肌梗死范围比较

2.3 各组大鼠心肌病理学改变 见图1。空白对照组大鼠心肌纤维排列整齐，未见间质内出现炎症细胞浸润、出血、水肿及纤维组织增生改变；再灌注损伤组可见大鼠心肌纤维断裂，灶状坏死，间质有炎症细胞浸润及出血灶；阳性对照组心肌病变较再灌注损伤组略有减轻，心肌纤维呈波浪状改变及空泡变性，间质少量炎症细胞浸润；四逆汤组大鼠部分心肌呈波浪状，间质见少量炎症细胞浸润，轻度水肿。

A：空白对照组；B：再灌注损伤组；C：阳性对照组；D：四逆汤组

2.4 各组大鼠心肌组织RohA、ROCK1、ROCK2蛋白表达比较 见表3(图2)。与空白对照组比较，再灌注损伤组RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相对表达量均升高；与再灌注损伤组比较，阳性对照组和四逆汤组RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相对表达量均下降，且四逆汤组以上蛋白相对表达量均低于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠心肌组织RohA、ROCK1、ROCK2蛋白表达比较

图2 各组大鼠心肌组织ROCK2、ROCK1、RohA蛋白电泳图

2.5 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达比较 见表4(图3)。与空白对照组比较，再灌注损伤组Bcl-2蛋白相对表达量降低，Bax蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与再灌注损伤组比较，阳性对照组和四逆汤组Bcl-2蛋白相对表达量升高，Bax蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。四逆汤组Bcl-2蛋白表达量高于阳性对照组，Bax蛋白相对表达量低于阳性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表4 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达比较

图3 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白电泳图

3 讨 论

现代医学研究认为，再灌注损伤可通过增强细胞通透性导致心功能损伤[6-7]。目前，心肌缺血再灌注损伤已成为AMI患者死亡的主要原因，积极寻找缺血再灌注损伤的治疗方法是AMI治疗的重点[8-9]。中医将MIRI归属于“胸痹”范畴，中医认为MIRI患者心肌缺血时属于阳虚阴盛，再灌注时阳虚阴盛骤然逆转，形成阴阳格局、阴盛格阳的病机，MIRI后病机为本虚标实[10]。四逆汤由附子、干姜、甘草三味中药组成，其中附子大辛大热，能破寒祛阴、温阳壮气，为方中君药；干姜可助阳散寒、通脉回阳，为方中臣药；甘草可补中益气，缓和干姜与附子的峻烈之气，调和药性，为方中使药。此方配伍精当，能回阳救逆，治疗阴虚阳衰证、心肾阳衰寒厥证等具有较好的疗效。

本研究结果说明四逆汤可减轻心肌缺血再灌注损伤，保护心肌细胞。既往研究表明，四逆汤可通过多条信号通路参与心肌梗死，保护心肌组织[11-12]。

MIRI发病机制复杂，涉及多个信号通路及途径，其中RohA/ROCK是心血管疾病发病的重要信号通路，心肌缺血时产生的多种细胞因子可激活RohA/ROCK信号通路，促使肌浆网释放Ca2+，Ca2+内流加剧钙超载，进而损伤心肌细胞[13]。本研究提示再灌注损伤可激活RohA/ROCK信号通路；与再灌注损伤组比较，阳性对照组及四逆汤组RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相对表达量均降低，且四逆汤组各蛋白相对表达量均低于阳性对照组，提示四逆汤可能通过抑制RohA/ROCK信号通路发挥心肌保护功能。

此外，心肌细胞凋亡也是MIRI导致心肌损伤的重要因素[14]。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，Bax基因属于Bcl-2家族，但其功能与Bcl-2相反，为促凋亡基因[15-17]。本研究检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白水平以评价大鼠心肌细胞凋亡情况。本研究发现，与空白对照组比较，再灌注损伤组Bcl-2蛋白相对表达量降低，Bax蛋白相对表达量升高，提示MIRI可导致心肌细胞凋亡；与再灌注损伤组比较，阳性对照组以四逆汤组Bcl-2蛋白相对表达量升高，Bax蛋白相对表达量降低；四逆汤Bcl-2蛋白表达量高于阳性对照组，Bax蛋白相对表达量低于阳性对照组，说明四逆汤有抑制心肌细胞凋亡的功效。

MIRI与氧化应激反应相关，MPO是白细胞酶，可反映中性粒细胞激活程度，同时反映血管内皮细胞损伤程度[18-19]。SOD、MDA活性分别表示氧化与抗氧化能力，SOD活性直接反映机体自由基消除能力，MDA反映氧自由基的产生与过氧化反应程度[20]。本研究发现，与空白对照组比较，再灌注损伤组大鼠血浆MPO、MDA水平均升高，血浆SOD水平下降，而阳性对照组以及四逆汤组大鼠血浆MPO、MDA水平均降低，SOD水平上升，且四逆汤组血浆MPO、MDA水平均低于阳性对照组，SOD水平高于阳性对照组，提示四逆汤可减轻抗氧化应激反应。

综上，四逆汤通过抑制RhoA/ROCK信号通路活性、抑制细胞凋亡、减轻氧化应激反应，有效减轻IR大鼠心肌损伤程度，发挥心肌保护作用。