益肾健脑汤联合针刺对脑梗死后轻度认知障碍患者血清miR-27-3p、miR-409-3p表达的影响

高梦菲，王朝霞

(1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.潍坊市中医院，山东 潍坊 261000)

老年患者脑梗后认知障碍发病率高达64%，且有不断升高趋势[1]。脑卒中后认知障碍是血管认知障碍的一种类型，是与脑卒中相关的重要并发症之一[2]。临床上对认知障碍治疗以康复运动、神经心理学疗法等为主[3-4]。本病属于中医学“痴呆”范畴，中医认为肾藏精生髓，髓上聚于脑，肾与脑以髓为桥梁，老年患者素体虚弱加之年老肾气不足，极易导致肾虚不能生髓，脑则失于濡养，元神散乱，出现情绪低落、认知不足、记忆减退等髓减脑消之症。脑卒中患者脑失于元神，神可调节精气血代谢，元神散乱，精气血不能正常代谢，也会引发肾脏失于濡养，不能生髓，进一步引发脑气血不足，髓海不充，加重病情。因此，脑部病变多采用补肾填精益髓法以调控元神、补肾精益髓海。近年来通过中药汤剂[5-6]、针刺[7-8]等方法治疗脑梗死后轻度认知障碍取得较好的临床疗效。本研究探讨益肾健脑汤联合针刺对脑梗死后轻度认知障碍患者血清微小核糖核酸-27-3p(Micrornas-27-3p，miR-27-3p)、微小核糖核酸-409-3p(Microrna-409-3p，miR-409-3p)表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年10月至2020年10月就诊于潍坊市中医院的94例脑梗死后轻度认知障碍老年患者为研究对象，按照随机数字表法分为对照组和治疗组，每组47例。对照组：男22例，女25例，年龄60～81岁，平均(69.75±5.35)岁；病程1～10个月，平均(4.28±1.12)个月；脑梗死部位中基底节区27例，脑叶6例，小脑4例，其他10例；合并高血压23例，2型糖尿病12例，高脂血症14例。治疗组：男18例，女29例，年龄61～78岁，平均(70.37±5.42)岁；病程1～9个月，平均(4.19±1.24)个月；脑梗死部位中基底节区31例，脑叶4例，小脑2例，其他10例；合并高血压21例，2型糖尿病14例，高脂血症12例。两组一般资料比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究通过伦理委员会批准；患者签署知情同意书。西医诊断标准：脑梗死诊断标准参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》[9]制定；脑梗死后认知障碍诊断标准参照《卒中后认知障碍管理专家共识》[10]制定。中医证型诊断标准：肾精亏虚证型参照《中西医结合康复临床实践指南·认知障碍》[11]制定。主症：沉默寡言，智力减退，腰膝酸软。次症：迟钝呆滞，记忆减退，头晕耳鸣，大小便失禁。舌脉：舌红少苔，脉沉或细弱。病例纳入标准：符合脑梗死后认知障碍的西医及中医证型诊断标准；未服用过其他中西医药物或未接受其他中医外治治疗。排除标准：严重肝肾功能不全者；既往有晕针史者；由甲状腺功能异常、脑部肿瘤等其他疾病引起的认知障碍者；合并严重心血管、血液疾病者。剔除标准：因个人原因主动退出治疗；治疗期间出现严重不良反应。对照组、治疗组各有1例患者自行退出治疗而脱落，治疗组共纳入46例患者，对照组共纳入46例患者。

1.2 治疗方法 两组均给予调整生活方式、戒烟限酒、低盐低脂饮食、积极康复训练等基础治疗；并给予抗血小板、降脂、改善脑循环等对症治疗。

1.2.1 对照组：给予针刺治疗。主穴：百会、四神聪及双侧风池穴。配穴：涌泉、太溪、气海及双侧血海、足三里、肾俞、三阴交。操作方法：选用0.25 mm×75 mm的毫针，75%酒精常规皮肤消毒，百会、四神聪穴平刺0.5寸，风池穴针身向咽喉方向针刺2寸，以咽喉部自觉胀麻痛感为宜；血海、肾俞、太溪、涌泉穴直刺1寸，三阴交、气海穴直刺1.5寸，足三里直刺2寸，以得气为宜。所有穴位予提插捻转补法，留针30 min左右，每10 min左右行针1次，1次/d，每周5 d。

1.2.2 治疗组：在对照组基础上给予益肾健脑汤治疗。方药组成：茯苓30 g，怀牛膝、白术各25 g，熟地黄18 g，山药、何首乌各15 g，石菖蒲、远志各12 g，山茱萸、益智仁、菟丝子各10 g，炙甘草6 g。随症加减：若兼血瘀，加鸡血藤12 g，当归15 g；若兼痰湿，加清半夏9 g，麸炒白术25 g；若气虚严重，加黄芪30 g，党参15 g。将以上中药加水煎至400 ml，早晚2次服用，每日1剂。两组均连续治疗12周。

1.3 观察指标 中医症状评分：根据《中药新药临床研究指导原则》[13]制定中医症状评分标准。主症评分包括沉默寡言、智力减退、腰膝酸软三项，按照症状无、轻、中、重分别计0、2、4、6分。次症评分包括迟钝呆滞、记忆减退、头晕耳响、大小便失禁四项，按照症状无、轻、中、重分别计0、1、2、3分。认知能力：从蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MOCA)评分、画钟测验(Clock Drawing Test，CDT)评分、简易智能状态检查量表(Mini-mental State Examination,MMSE)评分、日常生活能力(Activity of Daily Living Scale，ADL)评分四方面评价患者认知能力。参照MMSE、MoC检测标准制定相应评价标准[14]。MMSE≤27分存在认知障碍，MOCA评分≤24分存在认知障碍，分数越高，认知障碍越轻。ADL评分标准参照《轻度认知功能障碍筛查量表分析》[15]，10个项目共100分，60分以上为基本自理，评分越高其生活质量越高。CDT评分参照国内常用的3分计分法评估[16]，总分为3分，分数越高认知障碍越轻。侧支循环血流速度：分别在治疗前后通过SONARA/tek型经颅及周围血管多普勒仪行脑动脉彩色多普勒超声检测大脑前动脉收缩期峰值(Peak systole in anterior cerebral artery，PSACA)、大脑中动脉收缩期峰值(Peak systole in middle cerebral artery，PSMCA)及大脑后动脉收缩期峰值(Peak systole in posterior cerebral artery，PSPCA)。血清视锥蛋白样蛋白-1(Visinin-like protein-1，VILIP-1)、陷窝蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)、miR-27-3p、miR-409-3p表达水平：采集患者清晨外周静脉血10 ml，离心取血清后，采用酶联免疫吸附法测定患者VILIP-1、Cav-1水平，采用RT-PCR检测血清miR-27-3p、miR-409-3p表达水平。

1.4 疗效标准 根据患者记忆、认知、计算能力改善情况判定疗效[12]。显效：患者记忆、认知、计算能力显著改善，MOCA、MMSE、ADL评分较前增加30%。有效：患者记忆、认知、计算能力有所改善，MOCA、MMSE评分增加<30%。无效：患者记忆、认知、计算能力无改善，MOCA、MMSE评分也未增加。总有效率=显效率+有效率。

2 结 果

2.1 两组患者临床疗效比较 见表1。治疗后，治疗组总有效率86.95%，高于对照组的69.57%，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组患者临床疗效比较[例(%)]

2.2 两组患者治疗前后主症评分比较 见表2。治疗前，两组沉默寡言、智力减退、腰膝酸软主症评分比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后，两组以上评分均降低，且治疗组均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 两组患者治疗前后主症评分比较(分)

2.3 两组患者治疗前后次症评分比较 见表3。治疗前，两组患者迟钝呆滞、记忆减退、头晕耳响、大小便失禁评分比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后，两组以上次症评分均降低，且治疗组均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 两组患者治疗前后次症评分比较(分)

2.4 两组患者治疗前后认知功能评分比较 见表4。治疗前，两组MMSE、MOCA、ADL、CDT评分比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后，两组均升高，且治疗组MMSE评分、MOCA评分、ADL评分、CDT评分均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 两组患者治疗前后认知功能评分比较(分)

2.5 两组患者治疗前后侧支循环血流速度比较 见表5。治疗前，两组PSACA、PSMCA、PSPCA比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后，两组PSACA、PSPCA降低，PSMCA升高，且治疗组PSACA、PSPCA低于对照组，PSMCA高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表5 两组患者治疗前后侧支循环血流速度比较(cm/s)

2.6 两组患者治疗前后血清VILIP-1、Cav-1水平比较 见表6。治疗前，两组血清VILIP-1、Cav-1水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后，两组血清VILIP-1、Cav-1水平均降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表6 两组患者治疗前后血清VILIP-1、Cav-1比较

2.7 两组患者治疗前后血清miR-27-3p、miR-409-3p表达比较 见表7。治疗前，两组血清miR-27-3p、miR-409-3p表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组血清miR-27-3p、miR-409-3p表达水平降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表7 两组患者治疗前后血清miR-27-3p、miR-409-3p表达比较

3 讨 论

现代医学研究认为，脑梗死后认知障碍一方面与大脑认知功能的神经通路破坏有关，另一方面与神经递质分泌紊乱相关，脑梗死后大脑的炎症反应刺激受损神经元，引起细胞聚集诱发血脑屏障，造成认知障碍，作用机制复杂[17-18]。目前尚无行之有效的治疗认知障碍和痴呆症的西药，因此中医药治疗本病有一定优势。

本研究结果显示，治疗组可降低患者中医症状评分，提高患者认知功能，加快侧支循环血流速度。益肾健脑汤方中重用熟地黄滋肾阴填精髓，为君药。山萸肉补肝肾以涩精，山药补脾阴以固精，二者共为臣药。三药相配补肾精益精髓，直达病机；佐以茯苓、白术利水渗湿健脾，并防熟地黄之滋腻恋邪，益智仁、何首乌、菟丝子补肾气益精血，可增强臣药之功，菖蒲、远志共用醒脑开窍，一可调控元神，促进精气血代谢，又可恢复神机，安定神智，怀牛膝补肾健骨，固护人体正气，培元固本，增强体质。诸药共用，发挥补肾益精、调控元神之功。现代药理研究发现，益肾健脑汤君药熟地黄对中枢神经系统有抑制作用，通过cPKC通路来上调神经胶质细胞系衍生神经营养因子的基因表达治疗认知障碍，提高患者认知功能，提高认知功能评分[19]。远志、石菖蒲通过调控GABA能神经系统改善乙醇导致的Glu/GABA紊乱,恢复神经系统平衡，修复缺损神经系统[20]。药理学发现山茱萸有效成分环烯醚萜苷对神经元具有保护作用，抑制脑内蛋白的异常磷酸化，最终达到保护脑内神经元细胞功能[21]。山药的有效成分山药多糖能够增加机体免疫力，进一步增强细胞分化，同时具有抗氧化作用，清除脑内自由基达到保护神经元细胞的目的[22]。药理研究发现益智仁可改善患者认知障碍，其有效成分儿茶酸可发挥抗氧化、改善线粒体功能障碍及促进细胞增殖的作用，其乙醇提取物和半萜类成分可减少细胞损伤和凋亡，抑制促炎基因表达，达到保护神经元，改善患者智力的目的[23]。何首乌具有抗衰老作用，可延缓细胞衰老与凋亡，对人体免疫系统具有保护调节作用，另一方面何首乌有效提取物可增加脑内神经功能因子表达，增强乙酰胆碱含量以改善记忆力，减少细胞凋亡[24]。以上从现代药理学角度证实了补肾益髓汤各中药可提高患者认知功能，达到保护神经细胞目的，进而提高认知功能评分，发挥抗氧化、改善线粒体功能障碍增加回脑血流量，增加侧支循环血流速度，提高大脑中动脉血流量及血流速度，降低血管阻力，进一步扩张血管，改善脑循环，开放侧支循环，改善患者认知功能。

本研究结果发现，对照组单用针刺治疗也可改善患者中医症状评分、认知功能评分，增加侧支循环血流速度。一方面，针刺主取百会、四神聪、风池三穴，此三穴为头部穴位，遵循近部取穴，百会有开窍醒脑、回阳固脱的作用，可治疗头脑诸疾，四神聪清利头目、醒脑开窍，风池穴可通利官窍，三穴共用可醒脑开窍，直达病机。其中百会与脑联系密切，针刺百会能够进一步通过刺激大脑皮层神经来改善大脑认知功能，常与四神聪配伍，且四神聪可诱发皮质电位活动以改善脑供血，两者配合进一步修复受损的神经细胞，促进神经因子再生以增加脑部血流量。另一方面百会与配穴足三里配伍可醒脑开窍，改善患者认知障碍，针刺风池穴可改善患者的椎-基底动脉系统，改善局部供血增强醒脑开窍之功；血海是治疗瘀血症要穴，可改善全身血液循环，满足脑部供氧需求，减轻脑部缺血损伤，减少认知障碍的发生。选择足少阴肾经涌泉及太溪，本经取穴可改善肾虚诸症，培本固元，脾经三阴交可调补肾经气血，补血活血疏经通络，为补虚要穴，肾俞、涌泉、太溪、三阴交配伍可助肾气以生髓，为改善肾虚诸症的常用穴位，针刺此四穴可进一步改善患者肾虚髓减的临床症状。

VILIP-1表达升高与神经功能缺损程度呈正相关，可破坏神经细胞而诱发血脑屏障，引起神经损伤，患者认知功能降低，是缺血性卒中患者的典型标志物[25]。本研究发现，治疗组可显著降低血清VILIP-1表达水平，减少细胞凋亡恢复其认知功能。Cav-1参与血脑屏障的调节，其表达下降可改善神经功能障碍，改善脑血管储备功能，促进神经功能修复[26]。

外泌体被认为是多种疾病的潜在生物标志物，外泌体参与创伤性脑损伤中神经炎症的启动和调节，miRNA被证实与神经疾病密切相关[27-28]。已有报道证明miR-27-3p可以靶向PPARγ调控微细胞活化和炎症因子表达，qRT-PCR结果显示，miR-27-3p过度表达明显增加炎症细胞因子的表达，miR-27-3p表达上调可靶向PPARγ，然后促进小胶质细胞活化和炎症细胞因子表达，引发疾病进一步发展[29]。有研究显示，脑梗死患者血浆miR-409-3p表达显著高于健康对照组，根据梗塞体积分析血浆miR-409-3p水平发现，大梗死组血浆miR-409-3p水平高于中梗死组和小梗死组，与轻度组和中度组相比，重度组血浆miR-409-3p水平最高，血浆miR-409-3p水平与NIHSS评分呈正相关[30]。本研究结果发现，脑梗死认知障碍患者血清miR-27-3p、miR-409-3p表达水平较高，通过益肾健脑汤联合针刺治疗可下调血清miR-27-3p、miR-409-3p表达。

综上所述，益肾健脑汤联合针刺治疗可改善脑梗死患者的认知情况，降低血清VILIP-1、Cav-1水平，下调血清miR-27-3p、miR-409-3p表达水平，提高大脑中动脉血流速度，改善患者认知功能，临床疗效较好。本研究针对脑梗死后轻度认知障碍患者选择中医内外结合治疗，选用益肾健脑汤内服补肾益精、安神健脑，联合针灸治疗直接作用于脑部，发挥醒脑开窍之功，体现了中医内外联合治疗的优势。同时本研究也存在不足之处，需要进一步扩大样本量、增加结局指标，证实本研究的真实性与可靠性，日后可进一步行相关基础研究进行佐证。