ShRNA Piezo1通过VEGF/FGF-2抑制ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化形成

王秀玲，王正忠

动脉粥样硬化（AS）是临床上常见的疾病之 一，具有发病率高，危害大等特点[1,2]。AS的发病始于心血管的内膜，先后合并有多种病变，包括局部脂质及复合糖类积聚、纤维组织增生以及钙质沉着而导致斑块形成，并渐发生动脉中层退变，其继发性病变尚有斑块内出血、斑块破裂以及局部血栓形成。病变常常累及大、中肌性动脉，进而阻塞动脉管腔，导致所受累动脉所供应的组织或者器官的缺血或坏死[3,4]。目前针对AS的预防与治疗尚未找到有效手段，利用基因工程原理，寻求AS形成和发展的关键基因分子，并通过siRNA干扰技术进行基因沉默，从而特异性的阻断AS的形成，是一种有效的可行的手段之一。本研究寻找AS发生和发展的关键分子，利用基因干预技术，沉默基因表达，对于AS的预防和治疗具有重要意义。

Piezo1蛋白是最新发现的一种机械敏感性离子通道蛋白，与机械牵张应力的传导密切相连，且广泛表达于真核细胞[5,6]。研究表明，机械敏感性离子通道Piezo1蛋白参与胚胎血管的形成，Piezo1的过度表达可以促进心肌梗死动物中血管的新生，与血管内血液的流体力学密切相关[7,8]。然而Piezo1蛋白在血管动脉硬化中的作用尚未见报道。本研究利用ApoE(-/-)小鼠AS模型，构建Piezo1的基因沉默载体，小鼠腹腔注射shRNA-38A干扰载体，观察shRNA-Piezo1对ApoE(-/-)小鼠AS形成的影响，以求为临床上AS的治疗提供新的思路，报告如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物ApoE基因敲除[ApoE(-/-)]雄性昆明小鼠30只，均购自山东济南动物中心，均为SPF级动物，批号为鲁05316253777，周龄6～8周，体重25～31 g；基因正常雄性昆明小鼠30只，均购自山东济南动物中心，均为SPF级动物，批号：鲁05316253001，周龄5～8周，体重24～33 g。

1.2 建立AS模型以ApoE(-/-)小鼠为研究对象，置于SPF级动物实验中心，调节动物房温度为（21.45±2.08）℃，湿度为（57.21±5.44）%。饲以高脂饲料，诱导构建AS动物模型，模型成功率85%以上。

1.3 shRNA-Piezo1慢病毒载体的构建和筛选根据siRNA干扰载体构建的方法，构建机械敏感性离子通道Piezo1蛋白编码基因Piezo1的干扰载体，利用NCBI基因库查询鼠源性Piezo1蛋白的编码基因Piezo1的序列，Gene ID是234839，位于第8号染色体，基因编码为NC_000074.6；根据siRNA靶点设计原理，构建siRNA-Piezo1的干扰序列。设计3种干扰序列分别为：

shRNA-Piezo1-homo-3299：GCGTCATCATC GTGTGTAAGA；

shRNA-Piezo1-homo-5762：GCCTCAAGTAC TTCATCATCAACT；

shRNA-Piezo1-homo-1875：GCGTCTTCCTT AGCCATTACT；选取上海吉凯公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒载体作为酶切对象，加入shRNA-Piezo1干扰序列后，转染人胚肾293T细胞，进行克隆测定，质粒抽提，慢病毒的包装备用。

1.4 实验分组按照实验目的，将实验动物分成四组，每组10只。其中空白对照组是以健康雄性昆明小鼠为研究对象，给予普通饲料喂养8周，腹腔注射100 μg生理盐水，1/周，12周后处死。ApoE(-/-)阴性对照组是以ApoE(-/-)小鼠为研究对象，余处理同空白对照组。ApoE(-/-)AS组：以ApoE(-/-)小鼠为研究对象，给予高脂饲料喂养8周，其余处理同空白对照组。shRNA-Piezo1干预组是以ApoE(-/-)小鼠为研究对象，给予高脂饲料喂养8周，造模成功后，腹腔注射100 μg shRNAPiezo1慢病毒载体，1/周，12周后处死。

1.5 RT-PCR检测成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA表达水平四组小鼠处死后，解剖小鼠主动脉组织5 mg，加入1 ml的Trizol RNA iso试剂，电动研磨棒进行研磨，萃取小鼠主动脉组织的总RNA，TAKARA逆转录试剂盒处理RNA，将总RNA转成cRNA，4℃保存，TAKARA荧光定量PCR试剂盒。采用FS2000系统对PCR进行分析，反应条件：95℃预变性30 s；然后95℃ 5 s，60℃ 30 s，共进行40个循环。溶解曲线：95℃ 5 s；60℃ 1 min。降温：50℃ 30 s，1个循环。内参基因GAPDH、FGF-2和VEGF引物由上海生工生物工程有限公司生产。采用2-△△CT的方法计算目的基因的相对表达量（表1）。

表1 目的基因的引物序列

1.6 Western-blot检测四组小鼠处死后，解剖小鼠主动脉组织5 mg，电动研磨棒进行研磨，加入1 ml RIPA细胞裂解液，各组细胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的离心管中，在预冷4℃的离心机中离心，预设：5000 r/min，5 min后提取上清，经95℃煮沸后，收集蛋白备用。按照说明书制备浓缩胶10 ml，分离胶20 ml。上样后电泳分离，转膜后在4℃冰箱避光孵育过夜（＞12 h）。经一抗稀释液（Piezo1，FGF-2和VEGF）1:10000稀释后加入样本离子膜。第2 d用PBST稀释液洗膜，重复3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗经二抗稀释液1:1000稀释后孵育二抗1.5 h，用PBST稀释液洗膜，重复3次，而后用DAB显影液处理样本。Image J软件可以用来分析蛋白条带。

1.7 主动脉冰冻切片油红O染色四组小鼠处死后，解剖小鼠主动脉组织，甲醛-钙液混合物（40%甲醛和0.1 g氯化钙组成）固定30 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，利用石腊机制备主动脉石蜡，切片机切片后，利用40%酒精浸润30 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，60%异丙醇浸润10 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，置于油红O染液2 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，甘油明胶封片，显微镜下观察主动脉血管脂肪部分。

1.8 主动脉冰冻切片苏木精-伊红（HE）染色四组小鼠处死后，解剖小鼠主动脉组织，制备石腊，切片机切片后，利用40%酒精浸润30 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，60%异丙醇浸润10 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，苏木素染色液染色 5 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，伊红染色液染色90 s，PBS冲洗3遍，每次5 min，中性树脂封片，普通光学显微镜下观察斑块面积及形态。

1.9 免疫组化染色四组小鼠处死后，解剖小鼠主动脉组织，制备石腊，切片机切片后，利用40%酒精浸润30 min，PBS冲洗3遍，每次5 min，60%异丙醇浸润10 min，PBS冲洗3遍，每次5 min。加入一抗（FGF-2，VEGF）经1:500稀释后，湿盒避光4℃孵育过夜，TBS冲洗3遍，每次5 min，TBS漂洗后加入生物素辣根酶（HPR）标记二抗，常温避光孵育20 min，TBS冲洗3遍，每次5 min，DAB试剂盒孵育5 min，TBS冲洗3遍，每次5 min。光学显微下观察，对VEGF阳性细胞计数。

1.10 统计学处理实验结果应用SPSS统计软件19.0版本进行数据分析。空白对照组，ApoE(-/-)阴性对照组，ApoE(-/-)AS组和shRNA-Piezo1干预组四组的组间比较采用单因素方差分析（F检验），组间比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 shRNA-Piezo1慢病毒转染结果结果显示，按照预先设计的3种序列siRNA-Piezo1-homo-3299，siRNA-Piezo1-homo-5762和siRNAPiezo1-homo-1875。以293T细胞为靶细胞，分别采用10-1，10-2，10-3，10-4μl病毒量进行转染，从而选择最优的病毒滴度。结果显示，10-1μl慢病毒量转染率最高，病毒滴度为1×108TU/ml，图1。

图1 3种序列的基因测序和慢病毒转染结果

2.2 shRNA-Piezo1干扰载体的筛选RT-PCR检测结果显示，shRNA-Piezo1-homo-5762组的mRNA水平要明显低于shRNA-Piezo1-homo-1875组和shRNA-Piezo1-3299组，比较具有统计学差异（P＜0.05）；另外Western Blot检测结果显示shRNA-Piezo1-homo-5762组的Piezo1蛋白表达水平要明显低于shRNA-Piezo1-homo-1875组和shRNA-Piezo1-3299组，比较具有统计学差异（P＜0.05）。本研究选取shRNA-Piezo1-homo-5762作为干扰序列，进行后续试验，图2。

图2 3种序列的shRNA-Piezo1干扰载体的筛选结果

2.3 各组苏木精-伊红（HE）染色结果主动脉HE染色结果显示，空白对照组小鼠主动脉内膜和中膜平滑，形态正常，未见脂肪细胞浸润（图3A）。ApoE(-/-)阴性对照组中小鼠主动脉脂肪细胞浸润主动脉内膜（如黑色箭头所示），尚未侵及中膜（图3B）；ApoE(-/-)AS模型组小鼠主动脉壁内膜有粥样斑块形成，可见炎性细胞和泡沫细胞浸润（图3C）；shRNA-Piezo1干预组小鼠主动脉壁平滑，未见明显炎性细胞和泡沫细胞浸润（图3D）；四组小鼠主动脉粥样硬化斑块体积所占总体积的百分比见表2，其中，shRNAPiezo1干预组中主动脉粥样硬化斑块体积所占总体积的百分比与ApoE(-/-)AS模型组相比明显减少，具有统计学差异（P＜0.05）。

图3 苏木精-伊红（HE）染色（400×）

表2 各组HE染色主动脉粥样硬化斑块面积百分比

2.4 各组主动脉冰冻切片油红O染色结果主动脉油红O染色结果显示，空白对照组小鼠主动脉动脉壁内膜、中膜形态正常，未见动脉粥样斑块（图4A）。ApoE(-/-)阴性对照组中小鼠主动脉动脉壁中膜毛糙和断裂（图4B）；ApoE(-/-)AS模型组小鼠主动脉壁中膜粗糙，可见大量泡沫细胞浸润（图4C）；shRNA-Piezo1干预组小鼠主动脉有少许泡沫细胞浸润（图4D）；4组小鼠主动脉粥样硬化斑块体积所占总体积的百分比见表3，其中，shRNA-Piezo1干预组中主动脉粥样硬化斑块体积所占总体积的百分比与ApoE(-/-)AS模型组相比明显减少，具有统计学差异（P＜0.05）。

表3 各组油红染色主动脉粥样硬化斑块面积百分比

图4 冰冻切片油红O染色结果（400×）

2.5 RT-PCR和Western blot检测结果PT-PCR和Western blot结果显示： ApoE(-/-)AS模型组中FGF-2的mRNA相对表达量明显大于空白对照组（P＜0.05）ApoE(-/-)阴性对照组中主动脉FGF-2的mRNA相对表达量与空白对照组比较统计学差异（P＞0.05）； shRNA-Piezo1干预组中主动脉FGF-2的mRNA相对表达量与ApoE(-/-) AS模型组比较具有统计学差异（P＜0.05）。ApoE(-/-)AS模型组中VEGF的mRNA相对表达量明显大于空白对照组（P＜0.05）；ApoE(-/-)阴性对照组中主动脉VEGF的mRNA相对表达量与空白对照组比较无统计学差异（P＞0.05）；shRNA-Piezo1干预组中主动脉VEGF的mRNA相对表达量与 ApoE(-/-)AS模型组比较具有统计学差异（P＜0.05）。ApoE(-/-)AS模型组中FGF-2和VEGF蛋白的表达量明显大于空白对照组（P＜0.05）；ApoE(-/-)阴性对照组中主动脉FGF-2和VEGF蛋白的表达量与空白对照组比较无统计学差异（P＞0.05）；shRNA-Piezo1干预组中主动脉FGF-2和VEGF蛋白的表达量与ApoE(-/-)AS模型组比较具有统计学差异（P＜0.05）。

2.6 FGF-2，VEGF的免疫组织化学染色结果结果显示，ApoE(-/-)AS模型组中FGF-2和VEGF蛋白的棕色染色较空白对照组明显增加，shRNAPiezo1干预组中FGF-2和VEGF蛋白的棕色染色较空白对照组明显减少（图6～7）。

图6 FGF-2的免疫组织化学染色结果（DAB染色，400×）

3 讨论

图5 FGF-2和VEGF的mRNA相对表达量和蛋白灰度值

动脉粥样硬化（AS）是个逐渐变化的过程，始于内皮细胞的病变，然后伴随脂质沉积、炎症细胞浸润等密切相关[9,10]。AS的初始阶段是由血管内皮细胞的损伤所引起，在血管血流的刺激下，损伤内皮细胞释放各种激酶，例如丝裂原活化蛋白激酶，整合素家族分子，受体酪氨酸激酶以及G蛋白等，从而加剧AS的进展[11-13]。既往研究表明，血管血流剪切应力在AS的进展中具有明显的促进作用[14]。因此，寻找力学信号传导在AS进展中的作用具有重要意义。

图7 VEGF的免疫组织化学染色结果（DAB染色，400×）

机械敏感性离子通道Piezo1蛋白可以广泛表达于真核细胞，比如软骨细胞，髓核细胞，膀胱上皮细胞以及血管内皮细胞等[15-17]。而且，Piezo1对于血管生长发育具有重要作用，将小鼠敲除Piezo1后，会引起胚胎的死亡，而且在血管发育中，Piezo1蛋白也具有重要作用，Piezo1蛋白的突变会引起红细胞的发育异常，与镰状细胞综合症的发生密切相关[18]。另外，在血液流体力学的刺激下，Piezo1蛋白参与血管的重构，且在血管内皮细胞中敲除Piezo1，会引起血管的发育异常[19]。与之前研究相同，我们发现在血管动脉粥样硬化的小鼠模型中，Piezo1蛋白的表达明显增加，为探究Piezo1蛋白在AS进展中的作用，通过siRNA的干扰载体构建原理，构建shRNA-Piezo1的干扰载体，沉默Piezo1蛋白的表达，结果说明，Piezo1蛋白的表达与动脉粥样硬化之间存在一定关系，表明研究shRNA-Piezo1对动脉粥样硬化的潜在治疗意义。

本研究利用慢病毒作为转染方法，以人胚肾293T细胞为靶细胞，筛选有效干扰序列，结果表明，shRNA-Piezo1-homo-5762组的mRNA水平要明显低于shRNA-Piezo1-homo-1875组和shRNA-Piezo1-3299组，比较具有统计学差异（P＜0.05），说明，shRNA-Piezo1-homo-5762是有效的干扰序列。另外，shRNA相较于siRNA干扰载体，可以对Piezo1蛋白的表达持续抑制，通过腹腔注射AS小鼠模型的方法，探究shRNA-Piezo1对AS小鼠模型的作用。利用HE染色，油红染色和免疫组织化学染色方法检测shRNA-Piezo1对AS的保护作用，结果显示，shRNA-Piezo1能有效抑制AS，与ApoE(-/-)AS组相比，可明显抑制动脉中膜断裂和泡沫细胞浸润。说明shRNA-Piezo1对AS具有一定保护作用。

既往研究表明，生长因子血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）与AS密切相关，可促进血管的新生[20,21]。另外，在AS的进展过程中，VEGF首先集聚粥样斑块的基底部和中央位置，因为该处巨噬细胞较多[22]。而FGF-2与内皮细胞增殖密切相关。研究表明，血管内皮细胞受到损伤时，FGF-2表达量增多，促进内皮细胞的增殖，参与血管的重建，但由于无序的增生，导致血管构型的改变，从而进一步加重血管壁的狭窄，促进动脉中膜的断裂[23]。本研究推测Piezo1蛋白介导的流体力学信号可以通过生长因子VEGF和FGF-2的改变，促进AS的进展，利用RT-PCR，Western Blot和免疫组织化学染色等方法，检测VEGF和FGF-2的表达，结果显示相较于空白对照组，ApoE(-/-)AS组中VEGF和FGF-2的表达明显增加，而shRNA-Piezo1可明显抑制VEGF和FGF-2的表达。我们认为，VEGF和FGF-2可能作为机械敏感性离子通道蛋白Piezo1的下游信号因子存在，介导机械信号。而利用shRNA基因干扰技术沉默Piezo1的编码基因Piezo1后，可抑制VEGF和FGF-2的表达，从而抑制AS的进展。

综上所述，shRNA-Piezo1可通过抑制VEGF和FGF-2的表达，抑制AS进展，从而起到保护内皮细胞的作用。