和厚朴酚通过增加IL-10及HO-1表达对LPS诱导急性肺损伤小鼠的保护作用

王贵佐,刘 璐,张莹莹,陈芬芬,韩 冬*

(1陕西省人民医院呼吸与危重症医学科,西安 710068;2西安交通大学第二附属呼吸与危重症医学科;*通讯作者,E-mail:sesory@yeah.net)

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常见的临床危重症,由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭[1],目前临床上治疗以对症治疗为主,尚无有效的治疗药物及治疗措施,中重度ARDS的死亡率高达40%[2]。因此进一步明确ALI/ARDS发病的分子机制,并寻找针对其发病机制的干预药物,对ALI/ARDS治疗具有极其重要的意义。

目前研究发现炎症和抗炎反应失衡在ARDS发病机制中发挥重要作用。在感染、中毒、休克等因素作用下,Ⅱ型肺泡上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等可产生大量炎症介质[3]。这些炎症介质激活NF-κB等多种信号通路,促进IL-1β、IL-6及TNF-α等细胞因子分泌,加重肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞的损伤,造成肺组织通透性增加,肺泡表面活性物质减少,从而导致肺水肿、肺不张、肺损伤的进一步加重[4]。因此重建炎症反应与抗炎反应平衡可能是ALI/ARDS新的治疗方向。

和厚朴酚(honokiol, HKL)提取于木兰科植物厚朴的根、树皮,是传统中药厚朴的主要活性成分之一。和厚朴酚具有抗肿瘤[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]及抗菌[8]作用。临床前研究[9]发现和厚朴酚对ALI/ARDS具有一定的保护作用,但是具体机制尚待明确。另有研究[10]发现和厚朴酚可减轻炎症反应及抑制凋亡,从而对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型发挥保护作用,这种保护作用与血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)上调有关。因此和厚朴酚能否上调HO-1表达进而对ALI/ARDS发挥保护作用尚待进一步研究。

本研究应用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的ALI动物模型,评估和厚朴酚对LPS诱导ALI的保护作用,并进一步探索这种保护作用是否与HO-1的上调有关。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

24只健康SPF级BALB/c雄性小鼠,6～8周龄,体质量为22～25 g,由陕西省人民医院实验中心提供(动物生产许可证SYXK(陕)2016-006),提供标准饮食及水。和厚朴酚及脂多糖(LPS,Escherichia coli 055:B5)购于Sigma-Aldrich公司。地塞米松(dexamethasone,DXMS)购买于陕西省人民医院。兔抗鼠HO-1购于Cell signaling technology;HRP偶联的羊抗兔二抗购于Sigma-Aldrich。IL-1β、IL-6及IL-10检测试剂盒为R&D Systems ELISA试剂盒。RIPA裂解液购买于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备和实验分组 将24只小鼠采用随机数字表法分为4组:对照组(Con组)、LPS模型组(LPS组)、和厚朴酚组(HKL+LPS组)及地塞米松组(DXMS+LPS组),每组6只。4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉小鼠。和厚朴酚组给予腹腔注射和厚朴酚溶液(5 mg/kg),地塞米松组给予地塞米松2 mg/kg灌胃预处理,1 h后18G留置针进行气管插管建立人工气道,Con组给予60 μl无菌PBS溶液,LPS组、和厚朴酚组及地塞米松组分别气管内滴注LPS溶液(1 mg/ml)60 μl。24 h后用10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射深度麻醉、处死小鼠。对小鼠进行支气管肺泡灌洗,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)并离心,细胞沉淀进行细胞总数计数及分类计数。分离后的左肺组织进行病理学检查。利用ELISA法检测BALF中IL-1β、IL-6及IL-10浓度,免疫印迹法检测血红素加氧酶-1表达。

1.2.2 收集BALF及肺组织样本 用4 ℃预冷的无菌PBS 0.6 ml进行支气管肺泡灌洗,重复灌洗3次,BALF的回收率达70%。BALF离心10 min(4 ℃,1 000g)。分别收集上清和沉淀,上清液在-80 ℃存备用。BALF中沉淀用100 μl无菌PBS重悬,利用细胞计数板进行细胞总数计数。取细胞沉淀涂片行瑞氏-吉姆萨染色,光镜下行细胞总数及中性粒细胞计数。支气管肺泡灌洗后分离右肺组织并在-80 ℃保存。

1.2.3 肺组织病理学检查 对分离后的左肺组织利用10%中性缓冲甲醛液进行固定,然后对左肺组织进行脱水,透明,石蜡包埋后切片(5 μm),进行苏木精-伊红(H&E)染色,观察肺组织病理学改变。

1.2.4 ELISA法检测BALF中IL-1β、IL-6及IL-10浓度 利用ELISA方法检测BALF中IL-1β、IL-6及IL-10的浓度,所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 免疫印迹法检测血红素加氧酶-1表达 精密称取各组小鼠肺组织,根据RIPA裂解液使用说明书制备肺组织匀浆,肺组织与RIPA裂解液的比例为1 mg ∶7.5 μl,用玻璃匀浆器上下、旋转充分碾磨。在冰上裂解1 h后,14 000g离心20 min,取上清,利用Western blot检测各组小鼠肺组织血红素加氧酶(heme oxygenase, HO-1)表达的变化,应用GAPDH作为内参校正。

2 结果

2.1 和厚朴酚对肺组织病理改变的影响

与对照组相比,LPS模型组小鼠肺组织病理显示,肺泡及肺间质可见大量红细胞,炎症细胞大量浸润,肺泡间隔增厚,正常的肺组织结构明显被破坏。而和厚朴酚组及地塞米松组小鼠肺组织内炎症细胞的浸润显著减少,肺组织结构破坏明显减轻(见图1)。

图1 和厚朴酚对LPS诱导小鼠急性肺损伤病理改变的影响 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of honokiol on pathological changes of lung tissues in LPS-induced acute lung injury mice (HE,×200)

2.2 和厚朴酚对小鼠肺组织浸润炎症细胞数的影响

与对照组比较,LPS模型组BALF内炎症细胞总数及中性粒细胞数均显著升高(P<0.01,见图2)。与LPS模型组比较,和厚朴酚组和地塞米松组炎症细胞总数及中性粒细胞数显著减少(P<0.01)。

与对照组比较,**P<0.01;与LPS模型组比较,##P<0.01图2 和厚朴酚对LPS诱导急性肺损伤小鼠BALF内浸润炎症细胞数的影响 (n=6)Figure 2 Effect of honokiol on inflammatory cell numbers in BALF of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.3 和厚朴酚对BALF中IL-1β、IL-6及IL-10的影响

与对照组比较,LPS模型组BALF中IL-1β和IL-6的浓度显著升高(P<0.01),IL-10浓度未见明显增加(见图3)。与LPS模型组比较,和厚朴酚组和地塞米松组BALF中IL-1β及IL-6的浓度显著下降(P<0.01),IL-10浓度显著增加(P<0.01,见图3)。

2.4 和厚朴酚对小鼠肺组织HO-1表达的影响

与对照组比较,LPS模型组小鼠肺组织内HO-1蛋白表达较对照组未见明显增加。与LPS模型组比较,和厚朴酚组和地塞米松组小鼠肺组织内HO-1蛋白表达较LPS模型组小鼠显著增加(P<0.01,见图4)。

与对照组比较,**P<0.01;与LPS模型组比较,##P<0.01图3 和厚朴酚对LPS诱导急性肺损伤小鼠BALF中IL-1β、IL-6及IL-10的影响 (n=6)Figure 3 Effect of honokiol on secretion of IL-1β, IL-6 and IL-10 in BALF of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

与LPS模型组比较,##P<0.01图4 和厚朴酚对LPS诱导急性肺损伤小鼠HO-1蛋白表达的影响 (n=6)Figure 4 Effect of honokiol on the expression of HO-1 protein in lung tissue of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

3 讨论

ALI/ARDS是由多种肺内外因素诱导的肺部炎性损伤,病情进行性发展导致急性呼吸衰竭,是临床常见的危重症之一,目前缺乏有效的治疗措施,病死率极高[1,2]。因此迫切需要进一步寻找有效的治疗药物。本研究发现和厚朴酚对LPS诱导小鼠急性肺损伤动物模型具有一定的保护作用,这种保护作用可能与IL-10及HO-1表达增加有关。

既往研究[11]发现,雌性小鼠更能耐受脓毒症和失血性休克,且进入发情期的雌性小鼠性激素水平变化很大,而雄性小鼠在诱导脓毒症动物模型时更容易发生免疫抑制,故在本研究中利用雄性BALB/c小鼠诱导ALI/ARDS模型。

本研究中气道内滴注LPS 24 h后模型组可见以中性粒细胞为主的炎症细胞大量浸润,肺泡内可见大量红细胞,肺泡间隔增厚,正常的肺组织结构被破坏,BALF中炎症性细胞因子IL-1β和IL-6显著增加,提示急性肺损伤模型构建成功。而应用和厚朴酚干预后,上述改变被显著抑制,提示和厚朴酚对LPS诱导急性肺损伤具有一定的保护作用。

IL-10是人体内重要的抗炎性细胞因子,通过抑制炎性反应,重建炎症反应与抗炎反应的平衡发挥保护作用。在IL-10抗炎因子分泌显著减少的情况下,无法有效抑制炎症反应,导致炎症细胞大量浸润、组织水肿、器官功能损害,进而增加死亡率[12]。临床研究发现,在ARDS死亡患者的疾病初期,BALF中的IL-10浓度较低,提示IL-10不足导致炎症反应与抗炎反应失衡,从而加剧肺内炎症反应[13]。基础研究进一步发现吸入IL-10可显著抑制IL-6、IL-1β及TNF-α的分泌从而对ALI动物模型发挥保护作用[14,15]。在本研究中和厚朴酚预处理显著促进了IL-10的分泌,改善了急性肺损伤病理反应,提示和厚朴酚对小鼠ALI保护作用可能与IL-10的分泌增加有关。

HO-1是血红素加氧酶的应激诱导型,在保护炎症和氧化剂诱导的细胞及组织损伤方面发挥重要作用。数个研究发现在LPS诱导的肺损伤动物模型上,HO-1基因敲除小鼠动物死亡率增加,而上调HO-1的表达,可减轻低血压、器官功能障碍及肺部炎症,提高内毒素血症动物模型的生存率[16-18],提示上调HO-1表达可能成为ALI/ARDS干预的靶点。进一步研究发现和厚朴酚通过诱导HO-1表达对脓毒症小鼠急性肾损伤及大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型保护作用[10,19],提示HO-1是和厚朴酚发挥保护作用的靶蛋白。本研究发现在模型组中HO-1表达稍有增加,而和厚朴酚干预组小鼠HO-1表达明显增加,提示和厚朴酚对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用可能与HO-1的上调有关。

本研究提示和厚朴酚对LPS诱导小鼠急性肺损伤具有一定的保护作用,这种保护作用可能与IL-10的表达增加及HO-1蛋白上调有关,这为ALI/ARDS的治疗提供新的思路。