Fas/FasL途径在PM2.5诱导肺泡上皮细胞凋亡中的作用及机制

高彦军,林红卫,王在强,金发光

(空军军医大学第二附属医院呼吸内科,西安 710038;*通讯作者,E-mail:jinfag@fmmu.edu.cn)

随着工业化进程的发展,空气污染对气候、环境和健康构成了重大威胁,导致全球每年约700万人过早死亡[1]。大气颗粒物(particulate matter, PM)尤其是空气动力学直径小于2.5 μm的PM2.5,由于其体积较小,表面积较大,可以携带细菌和有毒化学物质进入细支气管和肺泡并不易排出,更易引起呼吸系统疾病和肺功能损伤[2]。多项流行病学调查及临床研究表明,PM2.5对慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管哮喘、肺炎甚至肺癌的罹患或加重有着明确的相关性[3-6]。PM2.5导致肺损伤的主要机制是氧化应激和炎症反应,活性氧(ROS)的产生和炎性细胞因子的分泌都可以通过诱导肺泡上皮细胞凋亡引起肺损伤[7,8]。

细胞凋亡的主要途径有外源性途径(死亡受体途径)和内源性途径(线粒体途径)[9],有研究发现内质网应激也可以促进细胞凋亡[10]。Fas/FasL是死亡受体途径中的一组重要信号转导途径,当FasL与Fas结合后,细胞内相关分子形成死亡诱导复合物(DISC),随后催化Caspase-8前体激活,继而激活下游Caspase-3,最终导致细胞凋亡[11]。因此,Fas/FasL可能在PM2.5诱导肺泡上皮细胞凋亡,进而引起肺损伤中发挥重要作用。本研究通过建立PM2.5诱导大鼠肺损伤模型,探讨Fas/FasL途径在肺泡上皮细胞凋亡中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

家兔抗Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3多克隆抗体购自美国Abcam公司,FasL中和性抗体(NOK-2)、Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司,Caspase-8特异性抑制剂(Z-IETD-FMK)购自美国R&D公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体购自Affinity公司,F-12K培养基、胎牛血清购自武汉普诺赛公司,兔抗GAPDH多克隆抗体、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、RIPA裂解液及其他试剂均购自康为世纪公司。

1.2 PM2.5样本采集与制备

本研究中PM2.5的采集方法参考本实验室先前的研究[12],于2019年6月至2020年12月在空军军医大学科技楼楼顶,采用全自动大气颗粒物采样器(MH1200,明华电子)收集PM2.5,将载有PM2.5的滤膜裁剪为小块,浸入去离子水中,超声振荡15 min,重复3次,洗脱的颗粒物用6层无菌纱布过滤,真空冷冻干燥,低温保存备用。实验前称取处理好的PM2.5,用PBS溶解配制不同浓度的PM2.5悬液,超声振荡混匀,密闭容器中高压蒸汽灭菌(121 ℃,20 min),置4 ℃冰箱备用,使用前再次超声振荡混匀。

1.3 实验动物分组及处理

6～8周龄雄性SD大鼠24只,体质量(200±20)g,由空军军医大学实验动物中心(生产许可证号:SCXK 2017-0021)提供,随机分为4组(n=6):对照组(PBS)、PM2.5低剂量组(2.5 mg/kg)、中剂量组(5 mg/kg)和高剂量组(10 mg/kg),用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠,建模方法采用气管滴注,于第1,3,5天滴入0.5 ml PM2.5混悬液(PM2.5低、中、高剂量组的滴注浓度分别为1,2,4 mg/ml),对照组滴注等量PBS,PM2.5混悬液的剂量选择基于本课题组之前的研究[13]并进行适当调整。最后一次气管滴注操作完成后24 h处死大鼠,立即开胸取肺组织标本。

1.4 CCL149细胞培养及处理

大鼠肺泡上皮细胞CCL149(美国ATCC)用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的F-12K培养基,于37 ℃、5%CO2条件下常规培养、传代。细胞接种于6孔板中,在细胞增殖达到80%～90%时给予PM2.5暴露处理。为了探索PM2.5暴露处理的最适浓度和作用时间,我们首先开展一期、二期实验观察PM2.5不同浓度及不同暴露时间对CCL149细胞凋亡率的影响。一期实验设对照组、25 μg/ml PM2.5组、50 μg/ml PM2.5组、100 μg/ml PM2.5组,PM2.5组每孔分别加入1 ml培养基和1 ml PM2.5混悬液(浓度分别为50,100,200 μg/ml),使其终浓度为25,50,100 μg/ml,对照组加入1 ml培养基和1 ml PBS,作用12 h;二期实验每孔加入1 ml培养基和1 ml 100 μg/ml PM2.5混悬液,使其终浓度为50 μg/ml,分别作用0,6,12,24 h。流式细胞仪检测一、二期实验CCL149细胞凋亡情况,具体方法见后述。

根据一、二期实验结果,考虑到体内外实验的差异以及PM2.5浓度过大、作用时间过长容易发生细胞坏死,比较后选择50 μg/ml PM2.5暴露处理12 h作后续细胞深入研究。将CCL149细胞分为4组:对照组、PM2.5组、PM2.5+NOK-2(FasL中和性抗体)组和PM2.5+Z-IETD-FMK(Caspase-8特异性抑制剂)组,PM2.5暴露处理组加入1 ml培养基和1 ml 100 μg/ml PM2.5混悬液(终浓度为50 μg/ml),对照组加入1 ml培养基和1 ml PBS,作用12 h。PM2.5+NOK-2组和PM2.5+Z-IETD-FMK组在加入PM2.5混悬液前1 h分别加入10 μg/ml NOK-2或20 μM Z-IETD-FMK进行干预。以上各组均设3组复孔。

1.5 肺组织病理学及细胞凋亡检测

取大鼠右上肺组织于4%多聚甲醛中固定,脱水、石蜡包埋、切片,标本行苏木精-伊红(HE)染色,光镜下进行组织病理学分析。肺组织细胞凋亡用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记(TUNEL)法进行检测,染色方法按照试剂盒说明书进行,在荧光显微镜下观察、分析。

1.6 流式细胞仪检测CCL149细胞凋亡

实验干预完毕,6孔板中加入0.5 ml胰酶消化液消化2～3 min,然后加入1.5 ml培养基终止消化,将单细胞悬液转移至离心管内,1 000 r/min离心5 min,弃上清,PBS充分洗涤后用结合缓冲液重悬细胞,用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法染色,立即上机检测细胞凋亡率。

1.7 蛋白免疫印迹(Western blot, WB)法检测肺组织和CCL149细胞相关蛋白表达

根据肺组织HE和TUNEL染色结果,选择中剂量组作为实验组,采用Western blot检测Fas/FasL途径上游分子Fas及凋亡最终执行者Caspase-3在肺组织中的表达。具体方法为:取大鼠右下肺约40 mg剪碎,加入适量RIPA裂解液(含1%PMSF和磷酸酶抑制剂)置于冰上裂解,提取大鼠肺组织蛋白,BCA法进行蛋白质定量,12% SDS-PAGE凝胶电泳,转移到PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭,加入相应一抗,Fas、Caspase-3、GAPDH稀释比分别为1 ∶1 000,1 ∶500,1 ∶2 500,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入二抗常温避光孵育1 h,TBST洗膜3次,化学发光成像系统(上海天能)进行显影拍摄,条带用GIS凝胶图像处理系统分析。

为进一步阐明Fas/FasL途径在细胞凋亡中的作用,检测CCL149细胞中Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白的表达水平。具体方法为:处理完毕的CCL149细胞倒掉培养基,加入适量RIPA裂解液冰上裂解,提取蛋白,后续Western blot操作方法同上述。其中Fas、Caspase-3、GAPDH一抗稀释比同上述,FasL稀释比为1 ∶500、Caspase-8稀释比为1 ∶5 000。

1.8 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件进行实验数据分析。所有实验数据以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理学改变和细胞凋亡

经HE染色,镜下可见对照组大鼠肺组织正常,肺泡结构清晰,肺泡腔及间质内无渗出,仅见少量炎性细胞;气管滴入PM2.5混悬液后,大鼠双肺表面多可见散在出血点和血斑,切面可见暗红色斑片,镜下可见肺组织结构紊乱,肺泡壁增厚、断裂,且有水肿、出血和炎症细胞浸润,尤以中剂量组和高剂量组变化明显(见图1A)。TUNEL染色结果显示,随着PM2.5浓度升高,肺组织细胞凋亡率逐渐升高,与对照组相比,中剂量组及高剂量组凋亡率差异有统计学意义(P<0.01),而低剂量组差异无统计学意义(P>0.05),低、中、高剂量组之间差异均有统计学意义(P<0.01,见图1B)。

2.2 PM2.5暴露后大鼠肺组织Fas、Caspase-3蛋白表达变化

与对照组比较,PM2.5中剂量组(5 mg/kg)大鼠肺组织中Fas和Caspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。

2.3 PM2.5暴露处理及NOK-2、Z-IETD-FMK干预对CCL149细胞凋亡的影响

PM2.5暴露后,CCL149细胞凋亡率明显增高,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,见图3)。与对照组比较,PM2.5组凋亡率明显增高(P<0.01,见图4)。经NOK-2、Z-IETD-FMK干预后,与PM2.5组相比,PM2.5+NOK-2组和PM2.5+Z-IETD-FMK组细胞凋亡率降低(P<0.01),但仍较对照组高(P<0.05,见图4)。

图1 PM2.5可致大鼠肺组织损伤和细胞凋亡Figure 1 PM2.5 induces lung injury and cell apoptosis in rats

与对照组比较,**P<0.01图2 PM2.5暴露处理后大鼠肺组织Fas、Caspase-3蛋白表达变化Figure 2 Protein expression of Fas, Caspase-3 in rat lung tissue after PM2.5 treatment

2.4 CCL149细胞Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达变化

PM2.5组、PM2.5+NOK-2组和PM2.5+Z-IETD-FMK组CCL149细胞中Fas蛋白表达均较对照组升高(P<0.01);与PM2.5组比较,PM2.5+NOK-2组和PM2.5+Z-IETD-FMK组Fas蛋白表达无明显变化(P>0.05，见图5)。

PM2.5组和PM2.5+Z-IETD-FMK组FasL蛋白表达较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.01);PM2.5+NOK-2组FasL蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与PM2.5组比较,PM2.5+NOK-2组FasL蛋白表达降低(P<0.05),而PM2.5+Z-IETD-FMK组FasL蛋白表达无明显变化(P>0.05)。

PM2.5组Caspase-8和Caspase-3蛋白表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);与PM2.5组比较,PM2.5+NOK-2组和PM2.5+Z-IETD-FMK组Caspase-8和Caspase-3蛋白的表达均明显降低(P<0.01),但仍较对照组高(P<0.05)。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与PM2.5组比较,##P<0.01图4 NOK-2和Z-IETD-FMK干预对PM2.5暴露后CCL149细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of NOK-2 or Z-IETD-FMK on apoptosis after PM2.5 treatment

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与PM2.5组比较,#P<0.05,##P<0.01图5 NOK-2和Z-IETD-FMK干预对PM2.5暴露后CCL149细胞Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达影响Figure 5 Effect of NOK-2 or Z-IETD-FMK on protein expression of Fas, FasL, Caspase-8 and Caspase-3 in CCL149 cells after PM2.5 treatment

3 讨论

空气污染是影响全球呼吸健康的主要环境问题[14]。有证据表明,空气中PM2.5浓度的增加与肺部疾病或心血管疾病发病率的升高有关[15]。呼吸道是PM2.5进入体内的关键通道,肺是主要受影响的器官[16]。本研究结果显示,经气管滴注PM2.5后,大鼠肺组织出现了明显的组织病理学改变,表现为肺组织结构紊乱,肺泡壁增厚、断裂,且有水肿、出血和炎症细胞浸润等,并且随着PM2.5浓度的增加,这些损伤特征更为明显。

本实验室之前的研究表明PM2.5可导致肺组织氧化应激和炎症反应[13],过量产生的活性氧(ROS)和炎性细胞因子是PM2.5诱导肺泡上皮细胞过度凋亡的关键因素[17]。有研究表明,肺泡上皮细胞过度凋亡是导致肺损伤的重要因素[18]。本实验结果表明,PM2.5可导致大鼠肺组织细胞和CCL149细胞凋亡,且随着浓度增加和作用时间延长,凋亡率明显升高。这与HE染色结果一致,提示肺泡上皮细胞凋亡可能是PM2.5致肺损伤的重要机制之一。考虑到体内外实验的差异以及PM2.5浓度过大、作用时间过长容易发生细胞坏死,从而影响实验结果,本实验选择50 μg/ml PM2.5暴露处理12 h进行后续细胞深入研究。

细胞凋亡的主要途径包括死亡受途径、线粒体途径和内质网应激途径,Fas/FasL系统是死亡受体途径中的一组重要信号转导途径,在许多细胞的凋亡中起主要作用,是某些疾病发生的基本机制[19]。Fas/FasL介导的细胞凋亡始于FasL与受体Fas的结合,使Fas形成能传递信号的活性形式——三聚体,Fas的胞内区死亡结构域(DD)可与Fas死亡结构域相关蛋白(FADD)偶联,然后再通过FADD的死亡效应结构域(DED)与Caspase-8前体偶联,形成死亡诱导信号复合物(DISC),活化Caspase-8,并释放到细胞质中,从而将胞外的凋亡信号传递到细胞内,迅速激活Caspase-3,最终启动细胞凋亡执行[20,21]。为了解Fas/FasL途径在PM2.5致肺损伤和细胞凋亡中的作用,本实验采用Western blot法分析了Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达情况。结果显示,PM2.5暴露后,大鼠肺组织和CCL149细胞Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白上调,上述蛋白表达的升高与肺组织病理学改变、TUNEL染色和流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果是一致的,说明PM2.5可以通过Fas/FasL途径诱导肺泡上皮细胞凋亡,这与本课题组先前的研究结果相符[12,13]。

已报道抑制Fas/FasL途径可减轻LPS和海水导致的急性肺损伤[19,22]。为明确PM2.5诱导的CCL149细胞凋亡与Fas/FasL上调之间是否有直接关系,本研究使用抗FasL中和性抗体NOK-2和Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK进行干预实验。结果表明,NOK-2可阻断Fas/FasL相互作用,保护CCL149细胞免受PM2.5诱导的细胞凋亡。Z-IETD-FMK也能有效地阻断PM2.5诱导的CCL149细胞凋亡,表明Fas死亡受体通路是由Caspase-8介导的。值得注意的是,本研究发现NOK-2不能影响Fas的表达但可以抑制Caspase-8和Caspase-3的剪切活化,Z-IETD-FMK抑制了PM2.5引起的Caspase-8和Caspase-3的剪切,但对Fas和FasL表达没有作用。这一现象说明,在凋亡通路中Fas和FasL结合出现在Caspase-8和Caspase-3活化的上游位置。

综上所述,PM2.5暴露可以诱导肺组织细胞的凋亡,Fas/FasL系统介导的肺组织细胞凋亡在PM2.5诱导的肺损伤中具有重要作用。这为从凋亡角度入手对PM2.5导致的肺损伤进行预防和临床救治提供了实验基础和理论依据。需要指出的是,无论是NOK-2还是Z-IETD-FMK都不能完全阻断PM2.5诱导的细胞凋亡,提示PM2.5致肺损伤的发病机制是复杂的,还有其他信号机制参与。因此,针对PM2.5诱导细胞凋亡的机制还需要进一步研究。