CD226分子影响Treg细胞功能参与小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎的发病

王 宁,徐 曦,姜朋涛,吕明华,胡志芳

(西安医学院基础医学部基础医学研究所,西安 710021;*通讯作者,E-mail:360308636@qq.com)

共刺激分子CD226组成性表达于多种免疫细胞上,可介导T细胞亚群的分化和功能、NK细胞的杀伤、血小板的活化和聚集、单核巨噬细胞和内皮细胞的黏附等[1],研究表明CD226参与了多种自身免疫性疾病发生过程中CD4+T细胞的激活过程[2]。Treg细胞是体内重要的CD4+T细胞亚群,通过抑制效应性T细胞发挥免疫调节功能,在维持机体对外源性和内源性抗原的免疫耐受中和稳定机体免疫微环境稳态平衡中具有重要作用[3],文献报道自身免疫性疾病发生与Treg数量降低或功能的异常密切相关[4];Treg细胞高表达CD226分子,沉默CD226分子后可增强Treg细胞功能[5]。

小鼠EAE模型是进行人类多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)研究的经典动物模型,为典型的自身免疫性疾病[6]。本课题组前期研究发现小鼠经CD226多克隆抗体处理后对EAE的易感性降低[7],基于此,我们提出CD226是否通过对Treg细胞发挥调控作用影响小鼠EAE发生发展的问题。为明确此问题,本研究利用野生型(wide type, WT)小鼠和CD226基因敲除(knockout, KO)小鼠构建EAE疾病模型,观察两组小鼠病情变化,并探讨CD226对EAE小鼠Treg细胞数量、功能和细胞表面标记分子表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级野生型C57BL/6背景小鼠,6～8周,体质量为18～22 g,购自第四军医大学实验动物中心。SPF级纯合子CD226 KO小鼠购自南京大学,将WT小鼠与KO小鼠合笼从而获得CD226 KO F1代杂合子小鼠,随后继续在F1代小鼠间合笼以获得F2代小鼠,通过鼠尾DNA基因鉴定筛选出CD226 KO小鼠为本实验所用,所有实验操作均已通过本校动物实验伦理审批(审批编号:NO.XJYYLL-20144433)。

1.2 方法

1.2.1 构建小鼠EAE模型 制备MOG35-55多肽抗原乳液,将6 mg热灭活结核菌株H37RA溶解于2 ml弗氏完全佐剂中制备成混悬液,将上述两种溶液冰浴研磨至油包水状态备用。选取6～8周龄C57BL/6背景WT小鼠和KO小鼠各6只,0.5%戊巴比妥麻醉后,每只小鼠在腋窝和腹股沟皮下注射200 μl MOG35-55多肽抗原进行免疫。在免疫当天和第2天分别给予每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200 ng以破坏血脑屏障[8]。免疫后30 d内每日进行EAE疾病评分、称量体质量、观察精神、进食和活动情况。EAE评分参考国际通用评分标准,无症状为0分;尾部瘫痪为1分;尾部张力完全消失且步态异常为2分;后肢瘸拐或部分瘫痪为3分;后肢完全瘫痪为4分;死亡为5分[9]。

1.2.2 分离小鼠脾脏单个核细胞 脱颈处死小鼠,无菌条件下取出脾脏置于200目筛网上并剪碎,加入5 ml小鼠淋巴细胞分离液并进行研磨,收集研磨液后在液面上缓慢加入0.5～1 ml RPMI 1640培养基,800g去刹车离心30 min后吸取白膜层细胞,加入红细胞裂解液裂解5 min,重悬后300g离心5 min弃除上清,重复操作以充分洗涤细胞;细胞计数后待用。

1.2.4 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TGF-β和IL-10水平 Treg细胞通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子发挥免疫抑制功能[11],分选两组小鼠EAE高峰期脾脏Treg细胞,anti-CD3/CD28(5 μg/ml)刺激3 d,检测细胞培养上清IL-10和TGF-β水平。按照ELISA试剂操作指南稀释标准品,加入待检样品后放置于37 ℃水浴锅40 min后洗板拍干,加入双蒸水和一抗工作液后置于37 ℃水浴锅中20 min,洗板后加酶标抗体工作液并将反应板置于37 ℃ 10 min,最后加入底物工作液100 μl,避光放置15 min后加入终止液100 μl,使用酶标仪检测450 nm处吸光度,绘制标准曲线,根据检测样品OD值计算出IL-10或TGF-β含量。

1.2.5 实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测Foxp3 mRNA相对表达量 Trizol法提取RNA,使用微量核酸蛋白浓度测定仪(NanoDrop)检测RNA浓度,保证OD260/OD280为1.8～2.0。按照Takara反转录试剂盒操作,反转录条件为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃不限时,cDNA产物保存于-20 ℃。使用Primer Premier 5.0软件设计引物并委托上海生工生物公司合成。Foxp3上游引物序列:5′-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3′,下游引物序列5′-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3′;以GAPDH作为内参照,上游引物序列:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列:5′-TGTAGACCATGTAG TTGAGGTCA-3′。按照Takara公司qRT-PCR反应试剂盒操作说明进行qRT-PCR操作,cDNA 1 μl,Forward Primer 0.5 μl,Reverse Primer 0.5 μl,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5 μl,ddH2O 3 μl,总量10 μl,设置3个复孔,使用实时定量PCR仪(Bio-Rad CFX96)进行扩增反应,条件为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,共35个循环。使用GraphPad Prism统计软件进行数据分析并绘制统计图表。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 6.0分析软件进行数据统计学分析,统计结果以均数±标准差表示,样本间差异比较采用独立样本t检验进行比较,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KO小鼠脾脏Treg细胞上成功敲除CD226分子

脾脏Treg细胞CD226表达水平结果显示:WT小鼠脾脏Treg细胞高表达CD226分子,表达水平为29.45%±1.43%;KO小鼠脾脏Treg细胞极低表达CD226分子,表达水平为0.1%±0.06%(见图1)。以上结果表明KO小鼠脾脏Treg细胞已成功敲除CD226分子。

图1 WT小鼠和KO小鼠脾脏Treg细胞CD226分子表达水平Figure 1 The expression level of CD226 in Treg from the spleens of WT and KO mice

2.2 敲除CD226分子后,小鼠EAE病情减缓

两组小鼠EAE评分结果显示:WT EAE组发病时间为(8.25±0.27)d,疾病评分为2.21±0.32;KO EAE组发病时间为(10.81±0.26)d,疾病评分1.60±0.31,两组间比较差异均有统计学意义(P<0.05,见图2)。此外,WT EAE组高峰期体质量减轻14.34%±0.69%;KO EAE组减轻较少(10.43%±0.37%),差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。结果提示敲除CD226后小鼠EAE发病减缓。

与WT EAE组相比,**P<0.01,*P<0.05图2 免疫后WT和KO小鼠EAE疾病评分和EAE高峰期体质量变化Figure 2 Changes of disease scores of EAE after immunization and body weight loss at the peak of EAE in WT and KO mice

2.3 KO EAE小鼠脾脏Treg细胞比例增加

两组小鼠脾脏CD4+T细胞中Treg细胞比例检测结果显示:WT EAE组Treg细胞比例为11.02%±0.53%,KO EAE组为17.39%±0.78%,明显高于WT EAE组(P<0.01,见图3)。分选两组小鼠脾脏CD4+T细胞,qRT-PCR检测Treg细胞转录因子叉头盒蛋白3转录因子(forkhead/winged-helix transcription factor box P3, Foxp3)mRNA相对表达量(见图3),结果表明KO EAE组相对表达量高于WT组(P<0.01)。以上结果表明敲除CD226后EAE小鼠Treg数量和比例增高。

与WT EAE组相比较,*P<0.05,***P<0.001图3 WT和KO小鼠EAE发病高峰期脾脏Treg细胞比例变化Figure 3 The percentages of Treg in spleen CD4+T cells from WT and KO mice at the peak of EAE

2.4 KO EAE小鼠Treg细胞分泌IL-10和TGF-β增高

检测两组小鼠Treg细胞培养上清IL-10和TGF-β水平,结果显示:WT EAE组和KO EAE组IL-10水平分别为(17.41±1.5)ng/ml和(31.8±2.9)ng/ml,KO EAE组明显高于WT EAE组(P<0.01,见图4)。WT EAE组TGF-β水平为(35.1±2.8)pg/ml,KO EAE组为(52.7±5.2)pg/ml,KO EAE组明显高于WT EAE组(P<0.05,见图4)。以上结果表明,敲除CD226后EAE小鼠Treg细胞分泌抑制性细胞因子增高。

与WT EAE组相比较,*P<0.05,**P<0.01图4 WT EAE和KO EAE小鼠Treg细胞培养上清IL-10和TGF-β表达水平Figure 4 The expression levels of IL-10 and TGF-β in the culture supernatant of Treg from WT EAE and KO EAE mice

2.5 KO EAE小鼠Treg细胞表达TIGIT和CTLA-4增高

检测两组小鼠发病高峰期脾脏Treg细胞TIGIT和CTLA-4表达情况,结果表明:KO小鼠EAE高峰期脾脏Treg细胞TIGIT表达高于WT EAE小鼠(26.43%±1.64%vs18.7%±2.17%,P<0.05,见图5);KO小鼠EAE高峰期脾脏Treg细胞CTLA-4表达高于WT EAE小鼠(65.92%±5.53%vs45.74%±4.84,P<0.05,见图5)。以上结果表明,敲除CD226后小鼠脾脏Treg细胞表达CTLA-4和TIGIT增高,推测CTLA-4和TIGIT在KO EAE小鼠上的高表达与Treg细胞增强的免疫抑制能力相关。

与WT EAE组相比较,*P<0.05图5 WT EAE和KO EAE小鼠Treg细胞TIGIT和CTLA-4表达水平Figure 5 Expression levels of TIGIT or CTLA-4 in Treg of WT and KO mice during EAE

3 讨论

MS是以中枢神经系统慢性炎症和脱髓鞘为病变特点的自身免疫性疾病,EAE小鼠是进行人类MS研究的经典实验动物模型[12],MS和EAE发病与过强自身免疫应答引起机体免疫耐受稳态打破密切相关[13]。Treg细胞是维持自身免疫耐受和建立免疫应答负调控的主要CD4+T细胞亚群,其数量异常和功能低下与MS和EAE的发生和发展密切相关[14]。

CD226为T细胞激活过程中重要的共刺激分子,研究表明CD4+T细胞及其亚群Treg高表达CD226分子,且在激活状态下表达升高,CD226分子可参与CD4+初始T细胞的发育和分化过程[15]、Th细胞的极化过程[16]和Treg细胞的功能调节。Nabekura等[17]发现应用抗体阻断CD226后可促进Treg细胞介导的免疫耐受从而缓解移植物抗宿主反应,缺乏CD226的CD4+T细胞培养上清抑制性细胞因子IL-10表达上升。本课题组前期实验结果发现,小鼠注射CD226多克隆抗体后对EAE易感性降低,血清中白细胞介素(interleukin,IL)-10表达升高[7],基于此,我们推测CD226可能通过影响CD4+T细胞亚群中Treg细胞参与小鼠EAE的发生。为对上述问题深入研究,我们构建了CD226 KO小鼠,应用MOG35-55多肽进行了小鼠EAE造模,结果显示KO小鼠EAE发病延迟、疾病评分低且体质量减轻较少,Foxp3+Treg细胞数量增高,分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β升高,以上结果说明敲除CD226分子后EAE小鼠Treg细胞数量增多,抑制性细胞因子分泌增多。

免疫分子CTLA-4和TIGIT在维持Treg抑制功能中发挥着重要作用[18,19],研究表明CTLA-4的表达受转录因子Foxp3调控[20,21],MS和RA患者体内CTLA-4基因表达异常[22];TIGIT可与CD226竞争性结合共同配体CD155和CD112,CD226-TIGIT+Treg细胞抑制功能增强[23,24]。为明确敲除CD226后EAE小鼠Treg细胞CTLA-4和TIGIT的表达有无改变,以及这种改变是否直接影响到Treg的功能,我们检测了两组EAE小鼠Treg细胞CTLA-4和TIGIT的表达情况。结果表明KO EAE小鼠Treg表达TIGIT和CTLA-4均有所升高。文献报道CD226缺乏促进Treg高表达TIGIT从而促进Treg扩增并增强免疫抑制功能,最终导致移植物抗宿主反应减弱[25],在缺乏CD226的情况下,TIGIT与配体CD155和CD112的交互作用增强,从而提高Treg细胞的增殖能力和抑制功能[17,25],CTLA-4+Treg细胞免疫抑制能力增强[26],因此,我们分析敲除CD226后Treg细胞高表达TIGIT和CTLA-4与Treg功能增强密切相关。

综合上述,本实验明确了敲除CD226后小鼠Treg细胞比例增高且抑制功能增强,致使EAE病情减缓,此结果可为后期开发靶向CD226分子治疗自身免疫性疾病提供一定的研究思路。