嵌合抗原受体-T细胞对弥漫大B细胞淋巴瘤患者Toll样受体4、核因子κB的影响研究

路晓辉，陈香莉

（1.焦作市人民医院，河南 焦作 454150；2.河南省人民医院，河南 郑州 450003）

临床研究结果显示，弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）属于最为常见的一种非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma,NHL）。其基本特点为具有较强的侵袭性，且具有高度异质性病理特征［1］。目前条件下针对该类患者实施治疗主要采取化疗方式。据相关统计结果数据显示，40%左右的DLBCL 患者一般在接受化疗治疗后完全缓解，但仍有超过50%的患者对化疗无任何反应，特别是由于多药耐药（MDR）引起复发转移或者进展，从而使得预后状况不理想［2］。近年来，过继性免疫治疗已被成功地用于恶性血液疾病的临床治疗中，尤其是基于基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体（CAR）-T 细胞可对肿瘤抗原进行特异性地识别，不受主要组织相容性复合体（MHC）限制的限制，对DLBCL 具有十分理想的临床疗效［3］。本研究主要探讨了CAR-T 对DLBCL 患者Toll 样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）及核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）的影响，现报道如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料

选择2017 年7 月至2020 年7 月焦作市人民医院收治的14 例DLBCL 患者作为研究对象，均给予CAR-T 治疗（观察组）。另外选择同期接受常规化疗治疗的14 例DLBCL 患者作为对照组。入选标准：①均为初诊患者，且此前未接受任何放疗或者化疗治疗；②患者组织标本均经手术或切除活检获取；③均经患者知情同意，且自愿签署知情同意书，并对组织标本用于实验研究工作了解；④均经WHO 制定的相关标准［4］，且均经医院病理学诊断为DLBCL；⑤资料完整。排除标准：①中途退出者；②过敏体质者；③具有精神疾病史者；④合并其他恶性肿瘤者；⑤对本研究用药过敏者。两组患者基础资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组患者基础资料比较（n=14）

1.2 研究方法

对照组采用常规化疗方案进行治疗，具体方法为：环磷酰胺（CTX）2～3 g/m2+依托泊苷（VP16）200 mg/m2，第1 天，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）10 μg/（kg·d）第5 天开始，对外周血进行监测分析，CD34+细胞＞20 个/μL 时加以采集。

观察组采用CAR-T 进行治疗。预处理方法：在CAR-T 细胞回输前的一两周，对患者进行预处理；预处理方案为：250 mg/（m2·d）CTX，第1 天至第3 天；25 mg/（m2·d）的氟达拉滨，第1 天至第3 天。CAR-T 细胞制备方法：①患者T细胞采集，使用血细胞分离机淋巴细胞采集流程，采集100 mL 的血细胞，经体外分离、纯化T 细胞；②体外制备CAR-T 细胞，经①中的方法采集所得的淋巴细胞，于细胞实验室中制备CAR-T 细胞，其具体的制备方法、制备过程、细胞数量以及质量控制等均由该实验室掌握。

1.3 观察指标

1.3.1 外周血TLR4 表达量检测方法 采用聚蔗糖密度梯度方法将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）进行提取。细胞总RNA 采用Trizol 法进行提取，然后逆转录为cDNA。以此作为模板，开展PCR 扩增反应。TLR4 引物均购自于上海生工生物有限公司。引物上游：5'-TACGCTAGCGACTAGCTACT-3'，下游：5'-GCGTACGTACGCTAGCGCAT-3'。扩增条件为：95℃下扩增5 min，95℃下扩增0.5 min，55℃下扩增0.5 min，72℃下扩增0.5 min，上述过程共计40 个循环。目的基因相对含量计算：RQ=2-ΔΔCt。

1.3.2 血NF-κB 的检测方法 取患者治疗前后清晨空腹状态下肘静脉血2.0 mL，应用乙二胺四乙酸（EDTA）进行抗凝处理，采用淋巴细胞分离液将单核细胞予以分离；细胞核蛋白与浆蛋白抽提试剂盒，将胞浆蛋白与胞核蛋白予以提取，所有标本均于6 h 之内完成蛋白抽提，并将其置于-80℃温度条件下保存。NF-κB 采用酶联免疫吸附法（ELISA 法）进行检测，全部操作均严格根据试剂盒上的说明书实施。

1.3.3 检测细胞增值 比较二代与三代CD19 CAR-T 细胞体外增殖能力：取传代CD19 CAR-T细胞，加入培养液和MTT 培养液，放置在培养箱中进行孵育，孵育细胞后弃掉细胞的培养液后，加入二甲基亚砜（DMSO）的原液，震荡10 min，等待所有的结晶全部得到溶液后，用酶标仪测量490 nm 处的波长，并对其OD 值进行计算。

1.3.4 疗效判定 完全缓解（CR）：DLBCL 病变完全消失，并且保持1 个月以上；部分缓解（PR）：DLBCL 肿瘤病灶经治疗后最大垂直直径乘积缩小超过50%，并且保持≥4 周；病情稳定（SD）：DLBCL 肿瘤病灶经治疗后最大垂直直径乘积明显缩小＜25%，或乘积明显增大＜25%；疾病进展（PD）：DLBCL 肿瘤病灶经治疗后最大垂直直径乘积明显增大＞25%，或患者产生新的病变。总有效率为CR 与PR 之和。比较T 淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）的水平。

1.3.5 T 淋巴细胞亚群 统计两组患者治疗前后T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）的水平变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二代与三代CD19 CAR-T 细胞体外增殖能力比较

三代细胞在各培养时间点（0 h、24 h、48 h）细胞体外增殖能力均显著大于二代细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 二代与三代CD19 CAR-T 细胞体外增殖能力比较（n=14,,%）

表2 二代与三代CD19 CAR-T 细胞体外增殖能力比较（n=14,,%）

2.2 两组患者治疗后临床疗效比较

观察组患治疗后，CR+PR 有效率明显高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.094,P=0.043）。见表3。

表3 两组患者治疗疗效比较（n=14）

2.3 两组治疗前后CD19+细胞百分率比较

对照组治疗后3 d 及7 d CD19+细胞百分率均大于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组治疗后CD19+细胞百分率均小于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），且观察组治疗后3 d 及7 d CD19+细胞百分率均小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组治疗前后CD19+细胞百分率比较（n=14,,%）

表4 两组治疗前后CD19+细胞百分率比较（n=14,,%）

2.4 两组患者治疗前后TLR4 与NF-κB 水平的变化情况比较

观察组治疗后3 d 及治疗后7 d TLR4 与NF-κB 水平较治疗前均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且观察组治疗后上述指标水平均小于对照组治疗后，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 两组患者治疗前后TLR4 与NF-κB 水平的变化情况比较（n=14,）

表5 两组患者治疗前后TLR4 与NF-κB 水平的变化情况比较（n=14,）

2.5 两组患者免疫功能指标比较

治疗后，观察组的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 两组患者免疫功能指标比较（n=14,）

表6 两组患者免疫功能指标比较（n=14,）

3 讨论

DLBCL 属于一种大B 淋巴细胞弥散性恶性增生性疾病，其异质性非常强［5］。DLBCL 为侵袭性淋巴瘤，发病初期不易被发现，且病情发展非常快，患者一旦发病，其淋巴结会迅速肿大，常合并淋巴结外疾病及骨髓侵犯等，一旦确诊已为晚期，死亡率高。相关研究结果显示：TLR 可通过从病毒与各自内源性分子中辨识出不同的病原相关分子模式，多表达于单核细胞、巨噬细胞及树突细胞等固有免疫系统细胞表面［6］。有文献报道称：TLR4 作为TLR 家族中的常见成员，不仅能够广泛地在自然杀伤细胞等免疫原性细胞表达，也在宫颈癌等恶性肿瘤细胞广泛表达［7］。YANG等［8］研究发现：TLR-4 可高表达于乳腺癌细胞之中。NF-κB 蛋白因子通过与核内增强子κB 部位之间特异性结合，以加速相关蛋白转录进程，在体液免疫与肿瘤发病进程中扮演着十分重要的角色。还有研究发现：TLR-4 可高表达于多种淋巴瘤细胞之中［9］，然而该因子具体作用机理尚未完全明晰。NF-κB 作为TLR-4 的一种十分常见的下游分子，可高表达于淋巴瘤、肺癌以及乳腺癌细胞之中。

近些年来，随着特异性识别B 细胞表面CD19的CAR-T 的研究及其在B 淋巴细胞血液恶性肿瘤临床治疗之中的广泛应用，此类疾病患者死亡率大大降低，生存率及治愈率进一步提升。本研究结果显示：治疗后观察组患者TLR4 与NF-κB 水平较治疗前显著降低（P＜0.05）。此结果提示：CAR-T 疗法对DLBCL 的临床治疗疗效可能通过降低患者机体TLR4 与NF-κB 水平而得以实现。

周伟等［10］研究表明，免疫功能和DLBCL 病情发展息息相关，而T 淋巴细胞亚群体内表达含量过低则会导致抑制或杀灭癌细胞失败，进而导致患者预后不良。本研究治疗后，观察组的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均高于对照组（P＜0.05），这表明CAR-T 细胞方案治疗DLBCL 患者能显著提升其T 淋巴细胞亚群水平。CAR-T 细胞方案有效治疗需T细胞与DLBCL 病灶细胞直接接触，而实体瘤中细胞浸润于正常细胞、肌纤维间，CAR-T 细胞方案难以进入内部。本研究采用第3代CAR-T细胞方案，其包含CD28 及4-1BB 两共刺激信号域，具有较高的体内增殖及存活能力，但仍有部分患者采用CAR-T 细胞方案治疗无效，可推测由于CAR-T 细胞很难在机体大量扩增、细胞功能缺陷，进而导致治疗失败。CAR-T 细胞方案联合检查点抑制剂能够明显提高治疗疗效。今后，笔者将监测CAR-T 细胞方案在体内存活增殖情况，以进一步提高、改进CAR-T 细胞工艺、以求在其他治疗方面获得更好疗效。

综上所述，CAR-T 治疗DLBCL 短期临床疗效较为显著，可有效降低患者机体TLR4 与NF-κB 水平。