酶联免疫分析法检测乙型肝炎表面抗原常见影响因素分析

李达

（汝阳县中医院 检验科，河南 洛阳 471200）

乙型肝炎是临床常见疾病。我国慢性乙型肝炎患者高达2 亿，其中1%患者会发展成为重度乙型肝炎［1］。目前关于乙型肝炎发生机制尚未完全明确，与乙型肝炎病毒（HBV）、肝细胞免疫损伤有关，及早诊断乙型肝炎有利于预后［2］。乙型肝炎主要作用的靶器官是肝脏，通过引起肝细胞结构发生变化，造成肝炎、肝硬化和肝功能衰竭等疾病［3］。乙型肝炎患者及乙肝病毒携带者是主要污染源，传播途径为血液、血制品、体液传播和母婴传播等。乙型肝炎病毒包含乙型肝炎表面抗原（HBsAg）［4］，是机体感染乙肝病毒最早出现在血清中的物质，也是诊断是否感染乙肝病毒的重要标志物。酶联免疫吸附法是临床常用的病毒检查方法，但往往会出现假阳性，不利于临床诊治。本研究对酶联免疫分析法检测乙肝表面抗原常见影响因素进行探讨，旨在为临床提高诊断质量提供可靠数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选择汝阳县中医院医院2019 年10 月至2021 年5 月接收的慢性乙型肝炎患者44 例血清样本作为研究对象。纳入标准：①符合全国中西医结合肝病学术会议制定乙型肝炎诊断标准；②患者知情同意；③既往病史明确。排除标准：①血样污染的患者；②合并其他肝疾病患者；③合并严重性基础疾病患者；④妊娠期、哺乳期患者。收集44 例患者血样，获得44 份HBsAg 阳性血清样本。试剂盒是安图试剂盒检测OD 值。检测仪器是URUANS 酶联免疫吸附检查仪。44 例患者中男21 例，女12 例；年龄18～74 岁，平均（52.57±3.74）岁；病程1～8 年，平均（5.17±0.39）年。

1.2 方法

抽取患者肘静脉血5 mL，离心处理后留下血清，将44 份血清平均分成四等份，计为A、B、C、D。

A 等份：44 份HBsAg 阳性血清样本按照阴性、阳性和空白对照组各设置2 个孔。加显色剂后，使用空白孔调零，为了更好的了解不同时间底物的显色情况，不加终止剂，但要在酶标仪上每5 min 检测1 次410 nm OD 值。

B 等份：在44 份HBsAg 阳性血清样本上做上下两排双孔，进行常规检测，空白对照处理同A份。加显色剂，将其再分成两等份。一份放在37℃水浴箱孵育15 min。另一份放在12℃室温内，孵育15 min，加上终止剂，在酶标仪上测定450 nm OD 值。

C 等份：将44 份HBsAg 阳性血清样本上做上下两排的双孔，进行常规检测，空白对照处理同A、B 份。加显色剂，将其再分成两等份，一份用试剂盒洗液洗板5 次，另一份使用自来水洗板5 次，并在37℃水育15 min，终止检测OD 值。

D 等份：将44 份HBsAg 阳性血清样本做三排孔检测，使用酶标记抗体40 μL、50 μL、60 μL，其余按照酶标操作说明书测定OD 值。

阳性标准：参考临界值进行评定。临界值=阴性对照孔OD 均值乘以2.1。临界值＜0.05 时计算结果，且结果需乘以0.05。阳性标准：临界值≥1，阴性＜1。

1.3 评价指标

比较不同时间HBsAg 阳性血清样本滴度平均OD 值、不同温度HBsAg 阳性血清样本滴度的OD值、不同洗扳OD 值和三种不同酶标记抗体加入量OD 值。

1.4 统计学方法

本文数据均使用SPSS 19.00 软件处理。计量资料以均数±标准差（）表示，两两比较用t检验，三组及以上比较用方差分析；计数资料以百分率（%）表示，用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间HBsAg 阳性血清样本滴度平均OD值比较

不同时间点5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min 平均OD 值比较差异有统计学意义（F=260.01,P＜0.001）。其中40 min 平均OD 值（0.71±0.02）最高，5 min 平均OD 值（0.41±0.02）最低。见表1。

表1 不同时间HBsAg 阳性血清样本滴度平均OD 值比较（n=44,）

表1 不同时间HBsAg 阳性血清样本滴度平均OD 值比较（n=44,）

2.2 两种不同温度HBsAg 阳性血清样本滴度OD值比较

37℃时HBsAg 阳性血清样本滴度OD 值为（0.99±0.32），高于12℃时HBsAg 阳性血清样本滴度OD 值（0.81±0.36），差异有统计学意义（t=6.94,P＜0.001）。

2.3 不同洗扳HBsAg 阳性血清样本OD 值比较

自来水HBsAg 阳性血清样本OD 值为（0.62±0.16），高于试剂盒洗液HBsAg 阳性血清样本OD 值（0.51±0.14），差异有统计学意义（t=8.09,P＜0.001）。

2.4 三种不同的酶标记抗体加入量OD 值比较

酶标记抗体加入量分别为40 μL、50 μL、60 μL 时的OD 值比较差异有统计学意义（F=8.87,P＜0.001）。其中50 μL 酶标记抗体加入量OD 值（0.77±0.19）最高，40 μL 酶标记抗体加入量OD值（0.72±0.12）最低，见表2。

表2 三种不同的酶标记抗体加入量OD 值比较（n=44,）

表2 三种不同的酶标记抗体加入量OD 值比较（n=44,）

3 讨论

乙型肝炎是临床一种常见和多发的疾病，病情较隐秘，在我国常见。最近几年，乙型肝炎发生率呈上升趋势。乙型肝炎临床表现有恶心、乏力和腹胀等症状。患者病情晚期，肝纤维化明显，严重影响患者生命健康。酶联免疫吸附法最早见于1971 年，是一种非均相高通量免疫分析技术，其原理是通过固相载体表面进行免疫学反应，使用酶作为免疫标记，建立起与检测物之间的反应署联合关系［5］。酶联免疫吸附法常见方法有双抗体较夹心法测抗体、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体和捕获包被法测抗体等。其中双抗体夹心法测抗原主要用于二价或二价以上的大分子抗原。双抗原夹心法测抗体主要适用于小分子激素、药物或毒素［6］。捕获包被法主要适用于病毒性感染的早期诊断。与其他检测方法相比，酶联免疫吸附法有成本低、稳定性好、特异性强的优点，对HBsAg 的检测对诊断、治疗和预防等有重要意义［7］。但酶联免疫吸附法检测HbsAg 结果容易受到溶血、酶标记抗体加入量和温度等影响，其OD 值存在差异［8］。

本研究发现，在酶联免疫吸附法中加样、孵育和洗板等整个过程中的各个细胞中出现问题会导致乙型肝炎病毒表面抗体假阳性的情况。尤其是在此过程中要注意患者的OD 值较大时要进行复查。研究结果显示，不同时间点5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min平均OD 值存在明显不同。其中40 min 平均OD值最高，5 min 平均OD 值最低。37℃下HBsAg 阳性血清样本滴度OD 值高于12℃。不同洗板中，自来水HBsAg 阳性血清样本OD 值最高。40 μL、50 μL、60 μL 酶标记抗体加入量OD 值中50 μL 酶标记抗体加入量OD 值最高，40 μL 酶标记抗体加入量OD 值最低。说明检测时间点、反应温度、洗板和酶标记抗体加入量均影响HbsAg 的OD 值。随着时间延长，OD 值显色越深，因此要准确把握显色时间。过早或过晚检测均会导致灵敏度的样本漏检，其中过长时间会导致浪费。显色温度过低会导致结合反应速度延缓，导致显色不充分［9］，会导致低值阳性样本的漏检。一般来说，洗板并不是酶联免疫吸附法的反应步骤，但却影响着试验结果。通过洗板分离和固相抗原、抗体结合的游离物质，可以显著减少血清样品中与反应无关的蛋白质和其他杂质从而提升特异性吸附［10］。洗板处理不彻底，会导致底本增高。酶联免疫吸附法测定中PBS 洗涤液中洗涤效果较好，但自来水洗板会增加本底增高，使假阳性增加［11］。

目前关于酶联免疫吸附法检测导致HbsAg 假阳性原因包括：①试剂盒因素。试剂盒是最直接影响酶联免疫吸附法检测结果的因素，选择合格、灵敏的试剂盒能提升检查结果。②血液标本。目前认为溶血会导致酶联免疫吸附试验假阳性，溶血后，血清中含有血红蛋白，血红蛋白会减弱过氧化酶活性，一步法难以完全脱洗，残留的过氧化酶能与包被抗体结合，从而增加假阳性风险［12］。③标本离心。部分血样离心不全，血液未能完全凝固导致血清没有分离完全时进行检查会导致检测反应孔出现凝血现象或残留细胞成分干扰，其中免疫复合物吸附在塑料表面，导致非特异性结果，从而影响检测结果，检测过程中尽可能选择血清，静止2 h 后再实行检测，同时加样后要及时孵育。④加样时间和洗板影响。前后血样标本加样时间过长，特别是夏天温度过高会导致HbsAg结果影响较大，温度和时间对显色非常重要，温度37℃的时间与显色的颜色深浅呈正比。加样过程中要保持显色剂不会出现外流现象。⑤操作不当。在检测过程中操作不当会影响HbsAg 结果，加样不准确或错误使用标本会影响检测质量。加样时必须使用一次性吸头，最好使用洗板机代替人工操作，坚持室内质控和阴、阳性空白对照组同时进行。

综上所述，酶联免疫吸附法检测HbsAg 结果多受温度、孵育时间和洗板和酶标记抗体加入量等影响，应准确处理。