不同针灸方法对KOA模型大鼠软骨损伤生物标志物MMP-1、MMP-3和TIMP-1的影响

任菁钰，王 顺，牟秋杰，田会玲，杨佳一，刘 浩，汪子栋，李志刚

(北京中医药大学，北京 100029)

膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是以局部软组织黏连、软骨变性退变和破坏为主的病理改变[1-3]，常以局部关节退变乃至畸形[4]及发作期中度以上疼痛甚则难以入眠[5]为临床特征。现代研究表明，针灸在临床治疗KOA具有可靠疗效[6-8]，其中如手针、电针和温针对KOA均具有延缓软骨退变的作用[9-11]，但这3种方法之间的效果异同却仍无明确结论。基于此，本研究拟通过大鼠KOA模型探讨不同针灸方法对KOA大鼠软骨损伤修复的干预差别及对相关生物标志物MMP-1、MMP-3和TIMP-1的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

北京维通利华生物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]，SPF级雄性SD大鼠50只，饲养于IVC大鼠笼中，适应性饲养7 d，随机分为正常组(N)、模型组(M)、温针组(W)、电针组(D)和手针组(S)5组，每组10只。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂 单碘乙酸盐、戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；0.25 mm×25 mm针灸针(中研太和医疗有限公司)；4 %多聚甲醛、甲酸脱钙液和苏木素染液(北京百诺威生物科技有限公司)；抗体MMP-1、MMP-3(proteintech中国公司)；TIMP-1(美国Abcam公司)；通用二抗、DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；感光胶片(美国柯达公司)。

1.2.2 仪器 ALLEGRA低温高速离心机(美国Beckman);ASP300S全自动脱水机、RM2245半自动轮转式切片机(德国徕卡仪器有限公司);HQ稳压稳流电泳仪、Trans-Blot SD半干转电转印仪(美国Bio-Ra公司);37400-001机械触觉测痛仪(Ugo Basile生物研究仪器公司);SDZ-V电子针疗仪(华佗牌苏州医疗用品厂有限公司)。

1.3 模型制备

1.4 干预方法

1.4.1 空白组及模型组 N、M组不做任何处理，共28 d。

1.4.2 手针组 造模成功后，S组采用规格0.25 mm×25 mm针灸针，选取鹤顶、阳陵泉穴[13]，刺入5 mm，200 r/min，行针1 min，留针20 min，每10 min行针1次。

1.4.3 电针组 D组在S组基础上针刺后接电针，疏波，1 mA，2 Hz，20 min/次。

1.4.4 温针组 W组在S组基础上将直径5 mm艾炷置于针柄，20 min/次。

S、D和W组均隔天干预，共28 d。

1.5 组织取材与检测方法

1.5.1 组织取材 干预28 d后，戊巴比妥钠麻醉，生理盐水灌注，血净后，将胫、腓和股骨肌肉组织剔净，随机取6只软骨入-80 ℃保存，随机取3只膝关节，入4%多聚甲醛固定48 h，冲水12 h，入甲酸脱钙液，脱至大头针轻松穿过组织，冲水6 h，入5%硫酸钠溶液12 h，冲水，脱水，包埋。

1.5.2 检测方法 行为学评价:采用Lequesne MG膝关节评分[14]分别于造模前0 d和造模后14 d(造模结束前S组死亡1只)进行模型评价；采用机械触觉测痛仪在干预前后对各组患肢进行检测。

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HE染色:切片脱蜡至水，苏木素染色3 min，分化液5 s，冲洗30 s，返蓝30 s，冲洗30 s，伊红染色1 min，冲水5 s，脱水透明，封片。

免疫组化法检测关节软骨中MMP-1、MMP-3和TIMP-1阳性表达:切片脱蜡至水，PBS 3 min×3，高压锅EDTA抗原修复8 min，H2O220 min，山羊血清20 min，MMP-1一抗(1∶200 μL)、MMP-3一抗(1∶100 μL)和TIMP-1一抗(1∶50 μL)，37 ℃，1 h，反应增强液30 min，通用二抗20 min，DAB底物液一滴镜下观察，显色后即刻清洗，复染8 s，冲水5 min，脱水透明，封片，Image-Pro Plus6.0软件分析IOD值。

Western blot检测关节软骨中MMP-1、MMP-3及TIMP-1蛋白表达:软骨加裂解液，液氮研磨，离心取上清，BCA法测定蛋白含量。取40 μg总蛋白电泳，初始80 V，溴酚蓝进入后100 V。电转30 mA，90 min。5%TBS-T脱脂奶粉封闭1 h。加一抗MMP-1、MMP-3、TIMP-1和GAPDH，4 ℃孵育过夜。加二抗孵育1 h，将膜入ECL混合液，X光片曝光，显影，定影，晾干保存，扫描，Image-Pro Plus6.0软件分析灰度。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 行为学结果

2.1.1 各组膝骨关节Lequesne MG评分比较 结果显示，造模前各组大鼠膝关节评分差异无统计学意义(P>0.05)，造模后除N组外，其余4组评分显著高于造模前，差异具有统计学意义(P<0.05)，证明采用MIA注射大鼠右侧膝关节建立KOA大鼠模型成功。见表1。

表1 各组膝骨关节Lequesne MG评分比较

2.1.2 各组大鼠机械刺激回缩阈值比较 结果显示，干预前M、W、D和S组较N组相比回缩阈值均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。W、D和S组与M组相比回缩阈值结果差异无统计学意义(P>0.05)。干预后W、D和S组较M组相比，回缩阈值均上升，在干预组中，其中D组与M组相比，D组较M组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组机械刺激回缩阈值比较

2.2 各组大鼠软骨组织病理形态比较

HE染色：N组软骨表层平整，细胞呈圆形或椭圆形；M组全层破坏严重，细胞破坏、增多紊乱，空泡明显；W组软骨较完整细胞增多紊乱，成簇聚集；D组软骨较完整，细胞较完整、增多紊乱，出现纤维化；S组软骨较完整，细胞较完整、增多紊乱，空泡明显，出现纤维化。见图1。

2.3 各组大鼠软骨组织MMP-1表达比较

2.3.1 免疫组化法检测 结果显示，M组较N组升高，W、D和S组较M组降低，D组较W组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余结果差异无统计学意义。见图2、表3。

表3 各组大鼠软骨组织MMP-1阳性表达比较

2.3.2 Western blot法检测 结果显示，M组较N组升高，D、W和S组较M组降低，W组较D组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余结果差异无统计学意义。见图3、表4。

表4 各组大鼠软骨组织MMP-1蛋白表达比较

2.4 各组大鼠软骨组织MMP-3表达比较

2.4.1 免疫组化法检测 结果显示，M组较N组升高，W、D和S组较M组降低，D组较S、W组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余结果差异无统计学意义。见图4、表5。

表5 各组大鼠软骨组织MMP-3阳性表达比较

2.4.2 Western blot法检测 结果显示，M组较N组升高，D、S组较M组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余结果无统计学意义。见图5、表6。

表6 各组大鼠软骨组织MMP-3蛋白表达比较

2.5 各组大鼠软骨组织TIMP-1表达比较

2.5.1 免疫组化法检测 结果显示，N、M、W和S组较D组均降低，D、S组较M组高，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余结果差异无统计学意义。见图6、表7。

表7 各组大鼠软骨组织TIMP-1阳性表达比较

2.5.2 Western blot法检测 结果显示，W、D和S组较M组均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余结果差异无统计学意义。见图7、表8。

表8 各组大鼠软骨组织TIMP-1蛋白表达比较

3 讨论

KOA的软骨损伤尤以细胞外基质(ExtracellμLar Matrix，ECM)中的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)的增高与基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的相应变化最为关键[15]，ECM通过合成及降解维持着动态平衡[16]，对关节软骨起着支撑和缓解外部压力的作用[17]，若因急性损伤、炎症等因素破坏了ECM稳态的平衡，则会激发ECM的内稳态平衡能力[18]，其中MMP-1可直接作用于软骨基质Ⅱ型胶原使其裂解，从而加快软骨的破坏和缺损[19]，而MMP-3可激活间质胶原酶及其他蛋白酶原从而扩大软骨的破坏进程[20]，TIMP-1则作为MMPs的抑制剂维持软骨基质动态平衡[21]。

本次研究中，MMP-1阳性、蛋白表达比较3种干预效果差异的趋势表现为D>S>W，其中D组较W组降低(P<0.05)，而S组与W组，S组与D组差异并无统计学意义(P>0.05)，说明本研究KOA模型中电针较温针更有利于降低MMP-1，从而保护软骨基质裂解与破坏，温针与手针及手针与电针对调节MMP-1仅有效果趋势而并无可靠证据证明效果差异。由MMP-3阳性表达比较可知，W、S和D 3组虽均较M组低，但D组较S、W组降低(P<0.05)，说明电针更有利于调节降低MMP-3。由TIMP-1阳性、蛋白表达比较可知，D组高于W、S和M组(P<0.05)，且各组效果趋势仍然是D>S>W，而其恰好与3组在MMP-1、MMP-3中的趋势相对应，即MMP-1、MMP-3越低则相应TIMP-1越高，说明温针灸和电针、手针3种方法可能通过调节上升TIMP-1从而抑制MMP-1、MMP-3以达到缓解软骨基质裂解破坏的干预效果。

在本研究结果中，电针更有利于调节TIMP-1上升，且抑制MMP-1、MMP-3下降，这与一些临床中关于温针灸的研究结果相反[22-24]，这可能因为中医学认为KOA由气滞血瘀、肝肾亏虚、风寒湿痹和湿热蕴结等病因所致[25]，而本研究通过注射MIA所造大鼠KOA模型并不涉及风寒、湿热、肝肾亏虚这3种因素，而仅针对气滞血瘀而设。故温针灸、电针及手针的效果差异仅涉及活血、化瘀、通络和止痛这几个方面，结果显示电针效果高于手针高于温针灸，这仅说明电针与手针治疗更倾向于单纯活血化瘀止痛，温针灸的热性可能不利于单纯的局部炎症反应，这是因为临床收集的KOA病例多为年龄偏大的患者，《黄帝内经》云：“女子，五七阳明脉衰”“丈夫，六八阳气衰竭于上”,偏于中年的患者其KOA病机多有阳虚因素，这是临床研究的局限性，这也是本研究的优势，将复杂因素剥离，单纯探讨不同针刺手法的具体疗效，更有利于发掘针刺的疗效与机制，并用以指导临床实践。

综上所述,电针、温针灸和手针3种方法均能有效降低MMP-1、MMP-3同时升高TIMP-1，但相比之下，电针更有可能调节上升TIMP-1从而抑制MMP-1、MMP-3，手针方法次之，温针灸效果则略逊于前两者。本研究下一步将尝试以风寒、湿热和肝肾亏虚等不同因素造模，进一步研究不同针灸方法干预敏化穴位对KOA的具体疗效差异，并深入研究软骨细胞外基质中MMPs和TIMP与炎性因子的影响关系。