大鼠miR-133a-3p 慢病毒载体的构建及稳转株建立

张志蕊， 陈耀平

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院，银川 750004）

迟发性性腺功能减退症（late-onset hypogonadism，LOH）是一种与老龄相关的临床和生化综合征，其特点是一系列特异的临床症状和血清T水平缺乏（低于年轻的健康成年男性参考范围）[1，2]。由于睾酮的作用广泛涉及生殖、皮肤、泌尿肌肉、骨骼、心血管等存在雄激素受体的系统，LOH 的发生会导致患者生活质量的改变，且使多器官系统的功能受到影响[3]。研究发现，循环miRNA 可以非常准确地作为衰老[4]、癌症[5-7]、肌肉疾病[8-9]和神经退行性疾病有前途的生物标记物[10]。课题组前期研究[11]发现，miR-133a-3p 在LOH 患者低表达，并且miR-133a 作为肌肉特异性的miRNA，能促进肌肉的成熟，降低肌肉蛋白质分解的速度而促进肢体骨骼肌的健康[12-13]。本研究通过构建过表达及干扰慢病毒载体并筛选建立miR-133a-3p 稳转细胞株，为进一步研究miR-133a-3p与LOH 的相关机制以及LOH 的诊断和治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SPF 级2 月龄SD 雄性大鼠3 只，体质量190～220 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供；大肠杆菌菌株DH5α，慢病毒载体GV309、GV280及Polybrene 均购自上海吉凯基因科技有限公司；DMEM 细胞培养液、标准胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco 公司；Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 和TB GreenqRTPCR、DNase I、TB Green Advantage qPCR Premix均购自日本TaKaRa 公司，Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司，限 制 性 内 切 酶AgeⅠ、NheⅠ及EcoRⅠ均购自美国NEB 公司；质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen 公司，miR-133a-3p 引物合成由广州锐博生物科技有限公司完成，质粒测序由上海吉凯基因科技有限公司完成；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）购自Abcam 公司。

1.2 大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（corpus cavernosum muscle cell，CCSMC）的原代培养及鉴定

采用改良组织块法原代培养大鼠CCSMCs[14]，选取2 月龄雄性SD 大鼠，颈椎脱臼或异戊巴比妥钠注射处死大鼠，放入75%乙醇浸泡15 min。在超净台无菌条件下剪开包皮，在阴茎脚处截取阴茎，将其迅速移入含双抗预冷PBS 中洗去血渍并除去尿道、纤维及脂肪等组织。

将海绵体组织剪成0.5～1.0 mm3的组织块（组织块太大影响细胞爬出，太小会对细胞有损伤），按0.5 cm 的间隔放置到涂有20%胎牛血清DMEM/F12 培养基的无菌T25 培养瓶底部，翻转培养瓶后加入3～4 mL 20%完全培养液，放入培养箱5 h 后翻转培养瓶，使组织与培养液充分接触，继续在培养箱内培养。第4 天显微镜下观察可见细胞从组织块中爬出，次日去除组织块继续培养。以后每隔2～3 d 更换1 次培养液，待细胞融合约90%时，用胰酶消化细胞，后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基终止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，将悬液置于培养皿中，静置20 min 后，将细胞悬液转移至另一培养皿中，再次静置、贴壁，反复2 次后，将培养皿放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期，细胞融合约90%，按1∶3 传代培养。同时载玻片放置于6 孔板中，传至P2 代，后按1×105个/孔接种，待细胞汇合约70%，行免疫荧光鉴定实验。

1.3 miR-133a-3p 过表达及干扰慢病毒载体的构建

1.3.1 慢病毒载体的构建 根据miRBase（http://www.mirbase.org/）数据库信息设计扩增大鼠miR-133a-3p 前体序列的引物及成熟体反向互补序列，引物信息见表1。构建miR-133a-3p 过表达慢病毒载体为GV309，原件顺序为hU6-MCSUbiquitin-EGFP-IRES-puromycin；构建miR-133a-3p 干扰慢病毒载体为GV280，原件顺序为S-UbiquhU6-MCitin-EGFP-IRES-puromycin，均由上海吉凯基因科技有限公司提供。用限制性内切酶AgeI 和EcoRI 在37 ℃条件下分别酶切载体GV309、GV280。3 h 后获得酶切后的线性载体。1）以大鼠基因组DNA 为模板扩增miR-133a-3p前体序列，扩增体系为（50 μL）：ddH2O 32.5 μL；5×PS Buffer 10 μL；dNTP Mix（4 μL）；上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL；模板（10 ng·μL-1）1 μL。扩增程序：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环后72 ℃延伸8 min。得到的PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳用DNA 纯化试剂盒进行切胶回收，然后将回收的片段和线性化载体进行重组反应，实现线性化载体和目的片段的体外环化。2）根据设计的反向互补序列分别合成两段寡核苷酸序列，见表2，合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90 ℃水浴15 min，自然冷却至室温，通过T4 DNA ligase 将双酶切线性化载体和退火双链DNA 连接，16 ℃过夜，得到重组产物。两种重组产物分别转化感受态大肠杆菌（escherichia coli）DH5α，涂布LB固体培养板上，37 ℃培养箱培养过夜，挑取平板上的单克隆进行PCR 鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于下游病毒包装。

表1 引物信息

表2 DNA 寡核苷酸序列

1.3.2 慢病毒包装 采用三质粒共转染293T 细胞的方法进行慢病毒包装，转染前24 h，消化对数生长期的293T 细胞，以含10%血清的培养基重新接种于10 cm 细胞培养皿，24 h 待细胞密度达70%～80%时，更换为无血清培养基，2 h 后向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA 溶液（GV载体质粒20 μg、pHelper1.0 载体质粒15 μg、pHelper 2.0 载体质粒10 μg），相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1 mL，在室温下温育15 min，混合液缓慢滴加至293T 细胞培养液中，混匀，培养箱中继续培养6 h，弃去培养基加入10 mL PBS 清洗1 次，加入含10%血清的细胞培养基继续培养48～72 h，收集细胞上清液，4 ℃、4 000×g 离心10 min，去细胞碎片，0.45 μm 过滤后，4 ℃、25 000 r·min-1离心2 h，弃上清，加病毒保存液，轻轻反复吹打重悬，充分溶解后10 000 r·min-1离心5 min 后分装，-80 ℃保存。

1.3.3 慢病毒滴度测定 测定前一天，将293T细胞按4×104个/孔铺96 孔板，准备7～10 个无菌的EP 管，将病毒原液按10 倍梯度稀释：每管中加入90 μL 无血清培养基，将待测定的病毒原液10 μL 加入第1 个管中，混匀后，取10 μL 加入第2 个管中，继续相同的操作直到最后一管；选取所需的细胞孔，弃去90 μL 培养基，加入90 μL稀释好的病毒溶液，培养箱培养24 h，加入完全培养基100 μL，48 h 后荧光显微镜下观察荧光亮度并拍照。根据绿色荧光蛋白的表达量计算病毒滴度，病毒滴度=荧光细胞数/病毒原液量。

1.4 感染复数

CCSMCs 细胞按5×104个/孔接种96 孔板，共21 孔。将miR-133a-3p up 及down 慢病毒稀释液及A/P 增强液分别加入相应的孔中，使其感染复数（multiplicity of infection，MOI）分别为0、1、10 及100，转染12 h 后将病毒液弃掉，添加新鲜培养基，继续培养72 h，荧光显微镜下观察并拍照。对感染效率进行评估，明确CCSMCs 细胞的感染条件及合适MOI。

1.5 稳定转染细胞株筛选

CCSMCs 细胞按1×105个/孔接种6 孔板，培养24 h 待细胞汇合约30%时弃掉培养基，加入MOI 为10 的病毒液培养24 h，更换新鲜培养基继续培养72 h，荧光显微镜下观察到绿色荧光后，加入含2 μg·mL-1嘌呤霉素培养基继续培养，每天更换培养基，当细胞汇合度达90%时提取RNA，检测miR-133a-3p 的表达。

1.6 qRT-PCR 检测mir-133a-3p 的表达

实验设为miR-133a-3p 过表达组、miR-133a-3p 干扰组、阴性对照组和空白对照组，以不感染病毒作为空白对照，感染病毒空载体作为阴性对照。当细胞汇合度达90%时，收集6 孔板中的细胞，用Trizol 法提取细胞总RNA，DNase I 处理 去 除RNA 中 的DNA 污 染，然 后 用Nanodrop 2000 测定RNA 的浓度及纯度，分别用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit，TB Green Advantage qPCR Premix 按照使用说明书合成miRNA 的第一链并进行qRT-PCR：95 ℃预变性10 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 个循环。用2-ΔΔCT计算基因相对表达量，实验重复3 次。

1.7 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 6 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 法。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代大鼠CCSMCs 的分离培养及鉴定结果

采用改良组织块法原代培养CCSMCs，选取2月龄雄性SD 大鼠。原代培养第4 天，显微镜下可见少许CCSMCs 从组织块中爬出，形态呈梭形（图1A）。当细胞生长至融合后，细胞高低起伏，呈现平滑肌细胞典型的“峰-谷”样生长（图1B），α-SMA 免疫荧光鉴定：荧光显微镜下可见绿色荧光分布在胞核和胞浆中，阳性率达90%（图2）。

图1 显微镜下原代培养的CCSMCs

图2 CCSMCs 免疫荧光鉴定（×200）

2.2 miR-133a-3p 慢病毒载体的构建及测序结果

miR-133a-3p 过表达及干扰慢病毒载体GV309 和GV280（图3A、B）。将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB 液体培养基中，37 ℃培养12～16 h，取适量菌液进行测序，并与miR-133a-3p 的反向互补序列进行比对分析。结果表明，测序结果与目标序列完全一致（图3C、D）。

图3 GV309 和GV280 载体结构及测序

2.3 慢病毒滴度测定

构建完成的miR-133a-3p 过表达慢病毒滴度为3×108TU·mL-1，miR-133a-3p 干扰慢病毒滴度为1×109TU·mL-1（图4）。

图4 慢病毒荧光法滴度测定（×100）

2.4 细胞转染和稳转株的筛选

miR-133a-3p 过表达及干扰慢病毒载体感染CCSMCs 细胞72 h 后，Polybrene 浓度为2 μg·mL-1时，转染效率最高，且效率>80%，筛选后得到目的细胞（图5、图6）。

图5 慢病毒转染72 h 后的CCSMCs（×100）

图6 嘌呤霉素筛选10 d 的CCSMCs（×100）

2.5 miR-133a-3p 相对表达量的测定

qRT-PCR 检测各组稳转株中miR-133a-3p的表达情况。如图7 所示，与阴性对照组相比，过表达组的miR-133a-3p 表达量升高，干扰组miR-133a-3p 的表达量降低（P 均<0.01），说明本研究成功构建了过表达及干扰miR-133a-3p 的稳转株。

图7 实时荧光定量分析过表达组和干扰组稳转后miR-133a-3p 的表达水平

3 讨论

LOH 的特征是随着年龄的增长，肌肉的容积、大小和力量下降，给予雄激素治疗，肌肉容积和力量会显著增加[2，15-16]。本研究采用改良组织块法培养原代大鼠CCSMCs，在组织块法原代培养第4 天，平滑肌细胞从组织块中爬出，第5 天开始会有成纤维细胞爬出，采用反复差速贴壁法去除成纤维细胞的污染获得高纯度的CCSMCs。本实验α-SMA 阳性细胞率达90%及以上，从而保证了后续实验的准确性与可靠性。

miR-133a-3p 是成熟的miRNA，它来源于两个前体miRNA（miR-133a-1 和miR-133a-2），成熟序列为22nt。miR-133a 具有肌肉特异性表达的特点，它通过肌肉生长的协同转录、选择性剪接调控因子、生长激素通路来调控骨骼肌细胞的增殖和分化过程。Chen 等[17]表明miR-133 可以通过靶向SRF 来增强小鼠成肌细胞的增殖；Huang 等[18]证实miR-133 在成肌细胞分化过程中上调，表明miR-133a-3p 也可作为miR-133家族的一员参与骨骼肌的生肌分化。同时miR-133a 已被证明可调节人主动脉内皮细胞中的eNOS 活性[19]，并参与炎症性心肌病[20]和内皮功能障碍[21]。Jiang 等[22]研究结果表明，miR-133a-3p在维持内皮健康的稳态和生理功能中有着重要作用。

源自人类免疫缺陷病毒的慢病毒载体是修饰真核细胞（如造血干细胞和神经细胞）基因的有力工具。慢病毒载体可以将外源基因或外源shRNA 有效地整合到宿主染色体上，从而实现目的序列持久性表达。慢病毒的宿主相对广泛，无论对分裂或非分裂细胞均有感染能力。特别对于一些较难转染的细胞，如干细胞、原代细胞、不分化细胞等，慢病毒也表现出较好的感染效果。本研究构建了miR-133a-3p 过表达慢病毒载体GV309 和miR-133a-3p 干扰慢病毒载体GV280，并对所构建的载体进行滴度测定。将构建成功的慢病毒载体转染大鼠CCSMCs，经嘌呤霉素的筛选，对转染后的CCSMCs 进行qRT-PCR 检测，结果显示过表达组miR-133a-3p 的相对表达量升高，干扰组miR-133a-3p 的相对表达量降低，说明成功建立了稳定表达miR-133a-3p 的细胞株，可为后续开展大鼠miR-133a-3p 的功能研究提供一定的实验基础。