整合素连接激酶在草酸钙晶体诱导肾小管细胞上皮间质转换中的作用

李彩霞， 李 元

（1.宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，银川 750004； 2.甘肃省人民医院中心实验室，兰州 730000）

肾结石是泌尿外科的一种常见疾病，它在全球的发病率和复发率较高。它的形成涉及草酸钙晶体的成核、生长、聚集、滞留等过程[1]。草酸钙的主要成分为一水草酸钙（COM）和二水草酸钙（COD），研究发现，肾脏中过量的草酸钙会引起肾小管上皮细胞的损伤[2]以及诱导肾小管细胞发生上皮间质转换（EMT），加重肾结石患者的疾病进程[3]。EMT 发生过程中，上皮细胞转换为间质细胞，引起细胞中细胞外基质（ECM）的重塑，而肾脏中ECM 重塑与胶原含量的变化以及和基质金属蛋白酶（MMPs）及组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的动态平衡[4]有关。

整合素连接激酶（ILK）是一种丝氨酸-苏氨酸激酶[5]。ILK 的异常表达与肾细胞癌[6]、肾小管间质纤维化[7]、糖尿病肾小球病变和先天性肾病综合征有关。Huang 等[8]研究发现，去除小鼠肾皮质集合管主细胞中的ILK，导致肾脏严重炎症和间质纤维化，ILK 表达量的变化在肾小管上皮细胞病变中扮演重要的角色。根据以上研究草酸钙能够诱导EMT 的发生并引起ECM 重塑，而ILK和肾脏疾病有着密切的关联。目前尚未发现有关肾结石疾病与ILK 之间是否存在关系的报道，本实验通过将HK-2 细胞暴露于COM 中，初步探讨ILK 在COM 诱导HK-2 细胞EMT 中的作用，为相关研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 主要材料

HK-2 细胞（中科院上海细胞库购买，产品编号：BNCC295668）；CCK-8 试剂盒和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）相关试剂购自碧云天生物技术有限公司；ILK、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 和β-actin 引物由Invitrogen 公司合成；Western blot所用α-SMA（GTX100034）、COL1A1（GTX112731）、Fibronectin（GTX1000516）、Vimentin（GTX100619）和TIMP-1（GTX108254）均购自Gene Tex 公司；ILK（12955-1-AP）、MMP-2（10373-2-AP）、MMP-9（10375-2-AP）和β-Actin（23660-1-AP）均购自Proteintech 公司；E-cadherin（#3195）购自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HK-2 细胞用含10%的胎牛血清（FBS）、DMEM 和Ham′F12 培养基常规培养于37 ℃的培养箱中，细胞生长融合度为80%～90%时，PBS 清洗2 次，使用胰酶消化并按1∶3 传代。

1.2.2 CCK-8 实验检测HK-2 细胞存活率 HK-2 细胞接种到96 孔板中，分为空白对照（NC）组、COM 组（6、24 和48 h）共4 组，每组设3 个平行复孔，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，在生化孵箱中孵育1 h 后在450 nm 吸光度检测，计算HK-2细胞的存活率。

1.2.3 qRT-PCR 检测 各组细胞中加入1 mL Trizol 裂解液裂解细胞，根据RNA 提取试剂盒操作说明提取RNA，然后逆转录为cDNA，根据试剂盒说明将cDNA 进行扩增，扩增条件如下：1）预变性：95 ℃2 min；2）变性：95 ℃15 s；3）退火/延伸：60 ℃15～30 s；4）重复步骤变性和退火/延伸：总共40 个循环；5）熔解曲线分析：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，见表1。

表1 引物名称、序列及产物长度

1.2.4 Western blot 检测EMT 和ECM 相关蛋白和ILK 蛋白表达水平 各组细胞用PBS 洗涤3次，提取蛋白，用Bradford 法测定蛋白浓度。本实验中Western blot 使用的一抗分别为兔抗βactin（1∶1 000）、兔抗α-SMA（1∶1 000）、兔抗Vimentin（1∶2 000）、兔抗E-cadherin（1∶1 000）、兔抗COL1A1（1∶1 000）、兔抗Fibronectin（1∶1 000）、兔抗MMP-2（1∶1 000）、兔抗MMP-9（1∶1 000）、兔抗ILK（1∶1 000）、兔抗TIMP-1（1∶1 000）；二抗浓度为1∶4 000。凝胶成像仪采集图像，以目标蛋白灰度值与内参β-actin 灰度值的比值评价蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本比较采用Dunnett-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COM 对HK-2 细胞形态的影响

NC 组中HK-2 细胞呈圆形或者卵圆形，大小均一，细胞间连接紧密，融合后呈鹅卵石样。COM 组中，HK-2 细胞形态变为长梭形，大小不一，大多数细胞表现为纤维细胞形态，细胞变形严重且连接较松散，随着HK-2 细胞暴露于COM中时间的延长，大多数HK-2 细胞表现为长条形及梭形，见图1。

图1 倒置显微镜观察200 μg·mL-1 COM 对HK-2 细胞形态的影响（×200）

2.2 COM 抑制HK-2 细胞的生长

CCK-8 结果显示，与NC 组比较，HK-2 细胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 时细胞存活率均降低（P 均＜0.01），COM 呈时间依赖性抑制HK-2 细胞的增殖活性，见图2。

图2 CCK-8 检测200 μg·mL-1 COM 对HK-2 细胞存活率的影响

2.3 COM 诱导HK-2 细胞EMT 蛋白表达

Western blot 结果显示，与NC 组比较，HK-2细胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 时Vimentin 和α-SMA 的蛋白表达水平均升高（P 均＜0.01），E-cadherin 蛋白表达水平降低（P＜0.01），Vimentin 和α-SMA 蛋白表达水平呈时间依赖性递增，E-cadherin 蛋白表达水平呈时间依赖性递减（P 均＜0.01），见图3。

图3 Western blot 检测HK-2 细胞Vimentin、E-cadherin 和α-SMA 蛋白的表达

2.4 COM 诱导HK-2 细胞ECM 蛋白表达

Western blot 结果显示，与NC 组比较，HK-2细胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 时COL1A1 和Fibronectin 蛋白表达水平升高（P 均＜0.01），COL1A1 和Fibronectin 蛋白表达水平呈时间依赖性递增（P 均＜0.01），见图4。

图4 Western blot 检测HK-2 细胞COL1A1 和Fibronectin 蛋白的表达

2.5 COM 对HK-2 细胞内MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表达水平的影响

qRT-PCR 结果显示，与NC 组比较，HK-2 细胞暴露于200 μg·mL-1COM 6 h 时MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表达水平差异均无统计学意义（P 均＞0.05），在24 和48 h时，MMP-2 和MMP-9 的mRNA 表达水平均降低（P 均＜0.01），TIMP-1的mRNA 表达水平均升高（P 均＜0.01），MMP-2和MMP-9 的mRNA 表达水平呈时间依赖性递减，TIMP-1 的mRNA 表达水平呈时间依赖性递增（P 均＜0.01），见图5。

图5 qRT-PCR 检测HK-2 细胞MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 相对表达水平

2.6 COM 对HK-2 细 胞MMP-2、MM P-9 和TIMP-1 的蛋白表达水平的影响

Western blot 结果显示，与NC 组比较，HK-2细胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 时MMP-2 和MMP-9 蛋白表达水平均降低（P 均＜0.01），TIMP-1 蛋白表达水平均升高（P 均＜0.01），MMP-2 和MMP-9 蛋白表达水平呈时间依赖性递减，TIMP-1 蛋白表达水平呈时间依赖性递增（P 均＜0.01），见图6。

图6 Western blot 检测HK-2 细胞MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 蛋白的表达

2.7 ILK 在COM 诱导的EMT 中的表达

qRT-PCR 和Western blot 结果显示，与NC组比较，HK-2 细胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24和48 h 时ILK 的mRNA 和蛋白表达水平均升高（P 均<0.01），ILK 的mRNA 和蛋白表达水平呈时间依赖性递增（P 均＜0.01），见图7。

图7 Western blot 检测HK-2 细胞ILK 的mRNA 和蛋白表达水平

3 讨论

肾结石是一种复杂的疾病，影响其形成的因素众多，在发达国家其发病率高达14%[9]。结石的成分复杂，大约80%由草酸钙组成[10]。肾小管细胞暴露在草酸钙晶体中会导致细胞的损伤，细胞的损伤为结石的黏附形成提供了位点且促进草酸钙晶体在肾脏中的沉积。本实验结果显示，正常的HK-2 细胞大多数为圆形或者鹅卵石样。COM 作用于HK-2 细胞后，HK-2 细胞变形严重，其形态变为长梭形，形成纤维细胞样外观，CCK-8 实验结果显示，COM 抑制HK-2 细胞的生长，HK-2 细胞存活率明显下降，以上结果说明COM对HK-2 细胞具有损伤作用，本实验结果与有关报道[11]一致。

草酸钙晶体可通过激活TGF-β1/Smads 途径诱导肾小管上皮细胞发生EMT[12]。EMT 过程中，上皮细胞失去上皮极性及细胞间连接，E-cadherin 等发生下调及Fibronectin、Snail 等出现上调[13]。实验结果发现HK-2 细胞暴露于COM中，E-cadherin 表达下降，α-SMA 和Vimentin 表达上升，HK-2 细胞形态发生改变，由鹅卵石状变为长梭形，表明COM 诱导HK-2细胞发生EMT。EMT发生过程中破坏肾小管基底膜转，分泌Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原，其中又以Ⅲ型胶原含量最为丰富，EMT 先前被认为是组织纤维化中ECM 相关蛋白的主要来源。有研究[14-15]表明，大多数肾脏疾病均表现ECM 沉积，引起肾脏功能的失常。草酸钙晶体作用于肾小管上皮细胞会引起TGF-β1/Smads等途径的激活，造成ECM 代谢异常。生理条件下，ECM 的产生和降解是平衡的，ECM 的降解主要受到MMPs 及TIMPs 的调控，MMPs 活性的变化以及数量决定ECM 重构。在肾脏中，MMP-2和MMP-9 主要在肾基质中表达，其功能作用是对肾脏中Ⅳ型胶原进行分解代谢[16]，维持肾脏中ECM 的稳定。TIMP-1 是重要的纤维化因子，通过与MMP-9 结合抑制ECM 的降解，其表达量的升高与疾病的发展呈正相关。本研究检测ECM 相关成分COL1A1 和Fibronectin 以及与ECM 代谢相关的酶，结果显示，COM 组中COL1A1 和Fibronectin表达水平升高，24、48 h MMP-2 和MMP-9 的表达水平下降，TIMP-1 表达水平上升，表明COM 诱导HK-2 细胞发生EMT 和ECM 堆积，引起HK-2细胞内发生ECM 重塑，与有关报道[17]一致，为研究ILK 在HK-2 细胞暴露于COM 中的作用机制奠定基础。

ILK 是一种重要的细胞信号传导分子[18]。近年来有研究[19]显示，ILK 在EMT 发生发展过程中起着重要作用，Zheng 等[20]发现将ILK 基因敲除后，能够抑制EMT 过程降低细胞的侵袭和转移能力，ILK 在ECM 的重塑中起着不可或缺的作用，它诱导EMT 的发生，同时上调Fibronectin 基质组装和下调E-cadherin 表达，引起了ECM 大量聚集。本实验结果表明COM 诱导HK-2 细胞发生EMT，引起HK-2 细胞发生ECM 重塑。进一步检测ILK 在HK-2 细胞中表达量的变化发现，随着HK-2 细胞暴露于COM 中时间的延长，ILK 的mRNA 和蛋白表达水平呈时间依赖性递增，提示ILK 可能参与COM 诱导的HK-2 细胞EMT 改变。

综上所述，本实验结果证实ILK 在HK-2 细胞暴露于COM 中表达增高，提示ILK 可能参与COM 诱导HK-2 细胞的EMT 的发生，其具体作用机制有待于进一步研究。