自然发酵腊肉中酵母菌的分离鉴定及其发酵特性研究

张秋会，王晗，祝超智，崔文明，王小鹏，余小领，王兴辉，赵改名

(河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州，450002)

发酵肉制品是指在天然或者人工控制的条件下，利用各种微生物发酵作用制作出来的具有特殊风味、色泽和质地，且可以保存较长时间的肉制品[1]。腊肉是一种中国传统的腌腊肉制品,因其主要在腊月加工生产而命名。腊肉的种类繁多,因其具有独特的烟熏色泽、气味及口感,而广泛流行于各地民间饮食中。随着现代消费者对于色香味形的需求,传统腊肉的生产已然逐渐跟不上现代食品所需的安全、营养、快捷的发展趋势[2-3]。

目前市面上腊肉制品多数为手工作坊式生产，腊肉中的微生物经过自然培养和发酵后，产生了独特的风味和口感[4-5]，但由于手工作坊生产条件的局限性，无法对产品中的微生物生长进行有效控制，有益菌的生长受到影响，导致产品风味产生了差异性，并且部分有害菌的生长，会造成产品的腐败变质等质量问题。我国在传统发酵肉类食品工业化生产和技术现代化的改造等各个方面研究起步较晚,这种情况严重制约了我国传统肉类食品加工行业的健康可持续发展。因此添加不同的有益菌种可以有效改善腊肉的生产工艺[6-7]。酵母菌作为发酵菌株的一种，一直应用于面粉、牛奶、酒类等产品。近年来，酵母菌开始应用于发酵类肉制品中，其与乳酸菌进行复配，可以增强发酵性能[8-9]。因此，筛选活性强、活菌数目多、适合发酵肉制品生产的优秀酵母菌，开发适合中国人口味的发酵肉制品微生物发酵剂，是目前肉类工业重要研究方向之一。

本研究以信阳腊肉和湖南腊肉为分离材料，对菌株进行分离纯化分子生物学鉴定，并对筛选出的菌株的发酵特性进行测定，找出适合腊肉加工生产的、发酵性能优良的酵母菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：信阳腊肉、湖南腊肉，农家自制。

试剂：孟加拉红琼脂、YPD液体培养基，青岛海博；氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)、碳酸钙、氯化钠、亚硝酸钠、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD 超净工作台，AIRTECH；Tprofessi Gradie梯度PCR仪,德国Biomera；F3全自动凝胶成像系统，SYNGENE；DYY-12电泳仪，北京市六一仪器厂；KB240可编程低温培养箱，BINDER；TU-1901紫外可见光光度仪，北京普析通用仪器有限公司；8次/s 拍击式均质仪，Easy MIX；230V/Hz涡旋振荡器，VORTEX GENIUS3。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

在无菌均质袋里，添加样品10 g和90 mL的无菌生理盐水，用均质机进行均质，用无菌生理盐水在无菌试管中依次进行10倍梯度稀释，选择3个合适的梯度，分别取200 μL稀释液涂布于孟加拉红琼脂平板上，30 ℃培养24～72 h，挑选符合酵母菌形态的菌落，进行反复划线纯化。对纯化好的菌株进行进一步的实验。

1.3.2 16S rDNA分子生物学鉴定

挑取单菌，加入20 mL无菌水在95 ℃、20 min的条件下进行PCR裂解，用所得的裂解液为模板。酵母菌所用序列如表1所示。PCR反应体系和反应时间如表2所示。

表1 通用引物序列Table 1 Universal primer sequences

表2 PCR反应体系和反应条件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

参考赵改名等[10]的方法，进行测序。应用NCBI数据库，使用BLAST对基因同源性比较，确认菌株名称。

1.3.3 菌株特性的研究

1.3.3.1 生长曲线和产酸曲线的测定

参考高绍金[9]的方法，并加以修改。吸取菌液于YPD液体培养基中，30 ℃培养50 h，每隔2 h测定其pH值和OD600值。

1.3.3.2 耐盐特性

参考徐鑫等[11]的方法，并加以修改。吸取菌液于NaCl质量分数为0%、2%、4%、6%的YPD液体培养基中，30 ℃培养24 h，测定菌液的OD600值。

1.3.3.3 耐亚硝酸盐特性

吸取菌液于NaNO2的添加量为0、50、100、150 mg/kg的YPD液体培养基中，30 ℃培养24 h，测定菌液的OD600值[12]。

1.3.3.4 耐酸特性

吸取菌液于pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的YPD液体培养基中，30 ℃条件下培养24 h，测定菌液的OD600值[13]。

1.3.3.5 产醇试验

吸取活化3代后的菌液，在孟加拉红固体培养基上划线，倒置于30 ℃培养箱培养2 h。长出可见菌落后，在培养基倒入TTC上层培养基，使其覆盖原来菌落。放置于30 ℃培养箱中培养4 h，记录菌落的呈色情况。

1.3.3.6 产气试验

采用杜氏小管发酵法，在30 ℃培养24 h后，观察杜氏小管中有无气泡产生，记录菌株的产气情况。

1.4 数据统计处理与分析

所有实验均重复3次。采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，数据间的分析采用单因素方差分析(one way ANOVA)，显著性水平均定位P<0.05。折线图使用Origin进行作图。

2 结果与分析

2.1 腊肉中微生物的分离与鉴定

对筛选出的腊肉中的酵母菌进行分离纯化，通过DNA序列比对，鉴定腊肉中酵母菌的种类。

获得各菌株的基因组后进行PCR扩增，并进行电泳检测。由图1可知样品的扩增产物约为500～750 bp，所有条带分子质量大小符合理论预期[14]。

图1 PCR凝胶成像Fig.1 PCR gel imaging

利用NCBI数据库，对分离菌株的DNA序列基进行BLAST分析，确定菌种鉴定结果。根据表3可知，信阳腊肉中含有汉逊德巴利酵母、季也蒙毕赤酵母；湖南腊肉中含有假丝酵母。

表3 腊肉中13株分离菌株的鉴定结果Table 3 Identification results of 13 strains isolated from Bacon

2.2 腊肉中分离酵母菌的特性研究

从分离得到的3种酵母菌中各选择1株代表菌株，开展特性研究。

2.2.1 耐盐特性研究

食盐是肉制品加工过程中重要的调味剂，对发酵肉制品的安全性和感官质量有重要影响，而耐盐特性是选择发酵菌种的重要因素之一[15]。腊肉中食盐的添加量一般为4%～6%(质量分数)，水分含量会随着发酵的进行降低，盐浓度随之提高，菌株能够有较好的NaCl的耐受性，可以在发酵过程中发挥自己的作用。许艳丰等[5]从腊肉中筛选的热带念珠菌和乳酒念株菌两种酵母菌中发现，当盐质量分数超出6%时，菌株基本失去活性，不适宜菌株的生长。

由图2可知，各菌株在NaCl质量分数为0%时生长量最大，表明高NaCl含量会抑制菌株的生长。其中，菌株J1-2在NaCl质量分数为6%条件下活性良好，相比较，H34和X35在NaCl质量分数为6%条件下活性更强，由此可以了解到这3种菌株均有良好的耐盐能力。这与刘英丽等[16]筛选出汉逊德巴利酵母和异常威克汉姆酵母的耐盐特性一致，均可以耐高NaCl浓度的环境。

图2 各菌种在不同盐浓度下的生长能力Fig.2 Growth ability of each strain under different salt concentration

2.2.2 耐亚硝酸盐特性研究

亚硝酸盐是肉制品加工生产过程中重要的食品添加剂，有利于促进发色、增进风味、抑制有害菌的生长，但是过量食用亚硝酸盐会对人体带来危害[17]。通常根据对发酵肉制品亚硝酸盐添加量和发酵产生亚硝酸盐，要求菌株最少耐受100 mg/kg的亚硝酸盐，最好可以在150 mg/kg的亚硝酸盐条件下生长良好。

由图3可知，X35和H34在100 mg/kg时活性很强，与之比较，菌株J1-2在150 mg/kg时依旧有较好的亚硝酸盐耐受性。由此可知，3种酵母菌均有很好的耐亚硝酸盐性，其中J1-2的耐受性更强。这与刘英丽等[16]、陶森等[18]筛选的汉逊德巴利氏酵母以及季也蒙毕赤酵母有差异，他们筛选出的酵母菌耐亚硝酸盐能力都比较强，这可能是他们所筛选的原料不同，一个是从豆豉里面筛选的，一个是从腌鱼里面筛选的,样品本身的亚硝酸盐含量较高，使其耐受性更强。

图3 各菌种在不同亚硝酸盐含量下的生长能力Fig.3 Growth ability of different strains under different nitrite content

2.2.3 耐酸特性研究

发酵过程中通常不以单一的酵母菌进行发酵，大多会加入乳酸菌进行复配，而乳酸菌具有较强的产酸能力，因此要求酵母菌需具有较强的耐酸能力[19]。由图4可知，菌株J1-2在pH为3.0时生长能力最强，这与姚志芳等[20]筛选的毕赤酵母和李默等[21]筛选的毕赤酵母的耐酸性相近,在pH为3.0及以上时菌株活性很好；与黄治国等[22]筛选的季也蒙毕赤酵母进行对比，两种酵母菌均可以在pH为3.0时很好的生长。X35和H34在pH为5.5时活性很强，但随着pH值的增加而逐渐失去了活性。与刘壮等[23]筛选的汉逊德巴利酵母进行对比，本研究中X35的耐酸能力较差，这可能是由于刘壮等是从酸度较高的葡萄汁中筛选的菌株，具有很强的耐酸性。结果表明在发酵初期时，在酵母菌最适温度下进行发酵，此时pH值较高，酵母菌活性很强，然后在乳酸菌的最适温度下进行发酵，发酵的效果最好。

图4 各菌种在不同pH下的生长能力Fig.4 Growth ability of different strains under different pH

2.2.4 菌株的生长曲线和产酸曲线研究

根据图5可知，3种菌株都在0～8 h时为迟缓区，此阶段菌株的生长速度较慢，时间较长；8～30 h时为对数区，此阶段菌株的生长迅速增长，在30 h时到达稳定期。与刘辉等[24]所用的酿酒酵母菌进行对比，3种酵母菌的稳定期滞后，但是在稳定期时，吸光度比刘辉的高；其中J1-2的活性最强，在稳定期时，菌液的浓度显著高于另外两种菌株。

图5 菌株的生长曲线Fig.5 Growth curve of the strain

根据图6产酸曲线可知，H34的pH值下降最快，在50 h时候pH值为4.79。其中X35和J1-2的最终的产酸能力差异性不明显。筛选出的酵母菌与姚志芳等[20]从牦牛瘤胃和青稞酒槽筛选的毕赤酵母和酿酒酵母进行对比，本实验筛选出的菌株产酸速度慢但产酸多。图5生长曲线可知，菌株的产酸和生长曲线对应的迟缓区、对数区和稳定期基本一致。一般情况下，乳酸菌的稳定期时间较早，产酸能力高于酵母菌[10]，酵母菌发酵可降低发酵肉制品的酸度，增加风味。

图6 菌株的产酸曲线Fig.6 Acid production curve of the strain

2.2.5 菌株的产气产醇研究

酵母菌在发酵过程产生气体会破坏发酵肉制品的质地，影响发酵产品的外观，从而严重影响发酵产品的销售。由表4可知，杜氏小管内均没有气泡生成，结果表明这几种酵母菌均不产气。酵母菌能利用发酵基质中的糖分，将其转化为乙醇，赋予发酵肉制品特殊的醇香风味，同时乙醇还可以与其他有机酸、醇类等风味相互转换，并生成乙酸乙酯等重要的风味物质。由表4可知，所有的菌株均产醇，H34的产醇能力最强。

表4 各菌株的产气产醇情况Table 4 Gas and alcohol production of each strain

3 结论

本实验以农家自然发酵的腊肉为原料，从中分离出13株微生物，经菌落特征以及DNA序列鉴定后，确定腊肉中有3种菌，分别为信阳腊肉中的汉逊德巴利酵母、季也蒙毕赤酵母，以及湖南腊肉中的假丝酵母。其中，季也蒙毕赤酵母在不同pH、NaCl浓度、亚硝酸盐浓度等条件下的生长能力均符合发酵肉制品菌株的基本要求，且该菌株的生长速度较快，可作为肉制品发酵剂的潜在菌株；假丝酵母和汉逊德巴利酵母可以在高pH的环境下进行发酵。这3种酵母菌有望在腊肉的工业生产中作为发酵菌种进行使用。