基于甲病毒载体兽用疫苗的研究进展

井汇源综述，段二珍审校

1.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南工业大学生物工程学院，河南 郑州 450001

病毒通过进化可在细胞内实现自身基因的高效表达，并激活免疫反应，使其成为疫苗研发中抗原的理想递送载体。由于甲病毒载体能够稳定携带外源基因，且诱导插入突变的概率极低，已成为重要的病毒载体疫苗平台。甲病毒（alphavirus）属于披膜病毒科（Togaviridae），以蚊为媒介传播，对马和人类致病，主要导致发热、关节炎和脑炎［1］。根据分布的地理位置和所致疾病，甲病毒分为旧大陆（Old World，OW）和新大陆（New World，NW）两个亚群。OW亚群甲病毒感染后，临床症状以发热、皮疹和关节炎为特征，称为关节炎型，其成员主要包括辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SINV）、罗斯河病毒（Ross river virus）、塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等［2］；致病性较强的委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV）、东方马脑炎病毒（Eastern equine encephalitis virus，EEEV）、西方马脑炎病毒（Western equine encephalitis virus，WEEV）则属于NW亚群甲病毒，称为脑炎型，感染后导致发热和脑脊髓炎，病死率分别为＜1%、50%～78%和3%～7%，神经后遗症发生率分别为14%、75%和90%［3］。因此，基于甲病毒载体的疫苗主要以SINV、SFV、VEEV的减毒或不致病的毒株为骨架改造而来。由于病毒具备复制的特性，使携带的抗原基因得以进一步扩增，从而提升抗原的表达水平；扩增过程中形成的双链RNA结构可与模式识别受体结合，激活树突细胞，因此这类疫苗本身即为天然佐剂［4］，甲病毒载体也可作为抗体的递送载体用于提供被动免疫保护［5］。基于甲病毒载体的兽用疫苗在动物体内可产生良好的免疫效果，该载体上存在甲病毒RNA聚合酶的基因，可模拟病毒的复制，因此携带的抗原基因在表达量、持续时间、免疫效果方面均优于亚单位疫苗、灭活疫苗和传统的DNA／RNA疫苗。本文就甲病毒作为抗原递送载体在兽用疫苗中应用的研究进展作一综述，重点阐述基于甲病毒载体疫苗的分类和特征，以期为新型兽用疫苗的研发提供参考。

1 甲病毒蛋白编码模式及生物学功能

甲病毒基因组全长11 000～12 000 bp，为单股正链RNA，包含2个开放阅读框，分别编码非结构和结构蛋白前体［6］。在结构蛋白中，Capsid基因为病毒衣壳主要成分，E1和E2形成二聚体位于病毒粒子囊膜，参与细胞表面受体识别，并介导病毒囊膜与细胞膜的融合和病毒基因组释放［7-8］。病毒基因组可直接作为mRNA翻译形成非结构蛋白前体nsP1～3，并通过read-through位于nsP3上的终止密码子，翻译形成第2个非结构蛋白前体nsP1～4。位于非结构蛋白前体的nsP2 C-端区域具有木瓜样蛋白酶活性，通过反式切割作用形成nsP4单体，经顺式切割作用形成nsP1单体，而nsP2～3的分离则既有反式切割又有顺式切割作用［3］。nsP1蛋白具备甲基转移酶和鸟苷酰基转移酶活性，除了负责病毒mRNA的加帽过程外，还可进行棕榈酰化修饰，从而将复制复合体靶向至膜结构表面，以协助RNA合成［9-10］。nsP2能够干预细胞凋亡、自噬、RNA加工、转运、翻译等多条细胞信号转导，这与其解旋酶、磷酸酶和蛋白酶活性有关［11-12］。nsP3包含N-末端macro结构域和甲病毒独特结构域，在NW和OW亚群甲病毒中高度保守，与复制密切相关［13-15］。nsP4是RNA依赖的RNA聚合酶，在复制复合体中负责负链基因组、基因组及26s亚基因组的合成［16-17］。由nsP1至nsP4组成的复制子是甲病毒载体疫苗的功能核心。甲病毒的基因组和蛋白合成过程见图1。

图1 甲病毒的基因组及蛋白合成示意图Fig.1 Schematic profile of synthesis of alphavirus genome and protein

2 基于甲病毒载体的疫苗分类

根据抗原递送的策略和依赖的启动子不同，可将基于甲病毒载体的疫苗分为质粒型DNA疫苗（plasmid DNA-based vaccine）、自我复制型mRNA疫苗（self-amplifying mRNA vaccine，SAM）和病毒样囊泡疫苗（virus-like vesicles vaccine，VLV）［18-20］。

2.1 质粒型DNA疫苗 基于甲病毒的核酸疫苗与减毒活疫苗类似，在体内可有效激活免疫应答并提供长期免疫保护［21］。通过在甲病毒复制必须基因之前添加真核细胞的RNA聚合酶Ⅱ启动子（如CMV启动子），可确保质粒型DNA疫苗进入细胞核后转录形成甲病毒基因组RNA，而26s亚基因组启动子则调控抗原基因的表达［22］。由于结构基因缺失，该疫苗不会包装子代病毒颗粒，安全性好，也称自杀性DNA疫苗（suicidal DNA vaccine）［23］。基于质粒型DNA疫苗能实现单次注射递送多种抗原基因，抗原编码区部分可根据流行毒株序列进行灵活替换，且不影响整个质粒分子的物理特性。但质粒的入核效率可极大影响疫苗的免疫效果，这是由于质粒DNA必须进入动物细胞核才能完成抗原基因的mRNA转录［18］。另外，质粒型DNA疫苗上存在的抗生素抗性基因及甲病毒非结构基因的表达产物对细胞正常生理过程的影响也较大，如LIU等［24］报道，病毒蛋白对宿主干扰素信号通路存在调控作用。

2.2 SAM mRNA疫苗分为传统的非复制mRNA疫苗和SAM，一项针对两种疫苗的对比试验结果发现，1.25 μg长度约9 300 nt的流感病毒SAM疫苗与80 μg长度约2 200 nt的传统mRNA疫苗对H1N1 PR8株攻毒的保护效果相当［19］。SAM疫苗通常包含帽子结构、5′非编码区（UTR）、病毒复制必须基因部分（如nsP1～4）、抗原编码区部分、3′UTR和polyA尾［25］。SAM通常以正链RNA病毒中的甲病毒、黄病毒和小RNA病毒为骨架，其中甲病毒研究的最为透彻。利用线性化质粒上T3、T7或SP6启动子进行体外转录的方式进行大规模工业化生产，不依赖真核细胞培养，极大降低了疫苗成本［26］。借助脂质纳米颗粒递送100 ng的SAM至小鼠体内，即可激活T细胞和B细胞免疫应答，可实现单个细胞表达超过105个拷贝的抗原mRNA，抗原蛋白于3 d后达到表达高峰，表达持续时间超过14 d［4］。目前，核酸疫苗体内递送效率低，针对大型动物免疫效果不佳，限制了该疫苗的发展。

2.3 VLV VLV又称复制限制性病毒样颗粒（replication restricted virus-like particle）或自我增殖型杂合复制子（self-propagating hybrid replicon particle），在形态大小和生物学功能上与病毒类似，感染细胞的效率更高，靶向性更好，也克服了核酸疫苗面临的不稳定性和体内递送效果不佳的难题［27］。VLV拯救基于反向遗传学和感染性克隆技术，且基因序列来源于2个及2个以上的亲本病毒，因此基于甲病毒的VLV通常分为两类：复制缺陷型（replicationdeficient）和复制完全型（replication-proficient）。复制缺陷型VLV的拯救过程依赖抗原表达质粒和辅助质粒，成熟的VLV仅装配甲病毒nsP1-4基因和抗原基因构成的杂合基因组，缺少结构基因，安全性好［28］。复制完全型VLV的拯救不依赖反式提供结构基因，成熟的VLV杂合基因组包含甲病毒nsP1～4基因、抗原基因和结构蛋白基因［20］。早期提供的反式结构基因通常来源于甲病毒自身，随后研究发现，弹状病毒科水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）和狂犬病病毒（rabies virus，RABV）的G基因能够替代甲病毒的结构基因，完成基因组包装及成熟VLV颗粒对细胞膜的吸附和膜融合等过程［29］。幼鼠和成鼠实验显示，表达RABV G蛋白的VLV毒力大幅降低，与当前使用的减毒活疫苗比较，VLV诱导脑组织炎症反应、细胞凋亡水平、实验动物体重下降程度和死亡率均明显降低［29］。VSVG蛋白对细胞具有泛嗜性，包裹VSVG的VLV可进一步扩大疫苗的宿主范围。3种基于甲病毒疫苗的特点见表1。

表1 3种基于甲病毒疫苗的特点Tab.1 Characteristics of three vaccines based on alphavirus

3 基于甲病毒载体疫苗的特征

3.1 宿主范围广泛 甲病毒载体的一个特征在于其宿主范围广泛。甲病毒的自然宿主是马，但甲病毒载体可用于包括偶蹄动物在内多种动物疫苗的研发。如基于SFV复制子的pSCA1载体，WANG等［23］开发了针对绵阳和山羊小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）的质粒型DNA疫苗，携带PPRV fusion基因，经肌肉注射BALB／c小鼠，间接ELISA法检测到特异性中和抗体，且初次免疫24 h后，IL-2、IL-10、IFNγ和TNF-α水平逐步升高；HOSSAIN等［30］利用基于VEEV载体的表达质粒和辅助质粒构建了表达牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）E基因的VLV，免疫血清中抗体含量IgG＞IgM＞IgA；MURGIA等［31］报道了针对基因Ⅰ型非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的VLV，以VEEV为载体，携带ASFV抗原基因p30、p54和p72。肌肉注射2 mL含（2～4.5）×107个甲病毒复制颗粒（replicon particles），ELISA结果显示，加强免疫2周后，血清中可检测到p30抗体，p30蛋白第111～130位氨基酸是抗体识别的重要抗原表位。另外，甲病毒疫苗也可用于宠物和禽类疫苗的开发。一项采用SINV载体表达犬细小病毒VP2蛋白的DNA疫苗免疫试验研究中，免疫后犬血清中可检测到特异性抗体、CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞［22］。在另一项鸭群攻毒保护试验中，构建表达了鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）E蛋白的重组SFV载体DNA疫苗，间隔2周经肌肉注射7日龄雏鸭，200 μg质粒 ／只，4周后血清中和抗体水平达最高峰，DNA疫苗免疫组的PBMC增殖、IL-4和IFNγ水平显著高于灭活疫苗免疫组；加强免疫2周后，采用强毒株AH-F10进行攻毒保护试验，DNA疫苗免疫可为鸭群提供完全免疫保护，而灭活疫苗组仍有部分实验动物死亡［21］。上述研究显示，甲病毒载体疫苗应用宿主广泛，具有广阔的应用前景。

3.2 抗原兼容性 甲病毒载体的另一个特征在于其抗原兼容性好。HOSSAIN等［30］研究表明，插入VEEV载体的BVDV E抗原蛋白为二型膜融合蛋白，基因大小约为1 100 bp。基于减毒VEEV TC-83株复制子的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）mRNA疫苗中，载体兼容的SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株S蛋白为Ⅰ型膜融合蛋白，基因大小超过3 600 bp，经肌肉注射C57BL／6小鼠1～10 μg RNA 14 d后，ELISA法检测S蛋白特异性抗体水平达109～200 μg／mL，50%抑制浓度达1∶226～1∶643，IgG2c水平高于IgG1，表明该疫苗激活了Th1免疫应答；同时该疫苗在非人灵长类实验中可诱导强烈的抗体反应，持续时间至少70 d，中和抗体水平与SARS-CoV-2感染者康复血清中含量相当［25］。同样基于VEEV TC83株骨架，JOHASON等［32］借助编码E基因和Capsid基因的辅助质粒，将马秋波病毒和胡宁病毒的GPC基因构建至VEEV载体基因组，豚鼠实验表明，该疫苗能够同时抵御两种病毒的感染，该研究为甲病毒载体同时兼容两种膜蛋白提供了证据。ZHANG等［33］将VEEV的结构基因替换为RABV G基因，构建了杂合型VEEV-RABV病毒，在BHK-21细胞中培养最高滴度达106pfu／mL，囊泡大小60～90 nm，球形而非子弹状，表明属于Ⅲ型膜融合蛋白的RABV G蛋白具备包装甲病毒基因组的功能；在致死剂量的小鼠颅内攻毒实验中，肌肉注射该疫苗诱导产生的中和抗体可提供完全的免疫保护。

4 基于甲病毒的猪瘟疫苗

目前，猪瘟疫苗是基于甲病毒载体的兽用疫苗中研究最多的。2007年，LI等［34］以SFV为载体构建表达猪瘟病毒E2蛋白的自杀性DNA疫苗，8周龄仔猪经肌肉注射600 mg，间隔3周加强免疫2次，4周后进行石门毒株攻毒试验，中和抗体水平的平均值达1∶422.4，可提供完全免疫保护；当该DNA疫苗注射剂量减少至100 mg时，免疫动物除了短期发热和低水平病毒血症外，无其他临床症状，依然能够产生高水平的中和抗体；进一步研究发现，该DNA疫苗在小鼠体内诱导了猪瘟病毒特异性的淋巴细胞增殖及细胞因子表达［35］。

在免疫策略方面，猪瘟病毒E2蛋白的DNA疫苗初次免疫后，与采用杆状病毒表达的重组E2蛋白比较，采用表达E2蛋白的腺病毒载体加强免疫时，BALB／c小鼠不仅产生了高水平的抗体，还更强地诱导了CD8+和CD4+T细胞增殖及IFNγ的表达水平［36］。在石门毒株攻毒试验中，采用DNA疫苗初次免疫、腺病毒载体疫苗加强免疫的策略，未出现任何临床症状和病毒血症，而单纯免疫腺病毒载体疫苗则达不到该效果［37］。SUN等［38］进一步构建了腺病毒递送表达E2蛋白的甲病毒复制子rAdV-SFV-E2，结果表明，2次免疫剂量为6.25×105TCID50或单次免疫剂量为107TCID50均能够提供完全的免疫保护。

5 小结与展望

综上所述，与传统疫苗比较，基于甲病毒载体的疫苗具备诸多优势，目前基于VEEV载体的艾滋病病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗及肿瘤疫苗均已应用于临床医学实验，为基于甲病毒的兽用疫苗开发提供了依据。在影响疫苗免疫效果的诸多因素中，佐剂的选择至关重要，TIAN等［39］发现，电穿孔技术及猪IL-2表达质粒与DNA疫苗结合使用，免疫效果更佳。未来，随着抗原、载体和佐剂的不断优化，必将促进更多基于甲病毒载体兽用疫苗的研发和应用［40-41］。