β-地中海贫血研究对象B细胞淋巴瘤因子11A基因rs4671393、rs766432位点检测分析

徐冬云，黄潭灵，李如凯

（深圳市宝安区石岩人民医院检验科，广东深圳 518108）

β-地中海贫血是一种单基因遗传病，主要流行于我国南方地区，该病在临床上从无症状到输血依赖均可发生，表现出较大的差异，并且目前暂无理想的根治方法，可严重影响地区的出生人口质量[1]。胎儿血红蛋白（HbF）的升高有利于缓解患者的病情，目前部分研究以B细胞淋巴瘤因子11A（BCL11A）为切入点，利用基因编辑技术提高HbF含量以缓解患者症状[2]。研究显示，HbF含量与BCL11A基因的单核苷酸多态性密切相关，并在不同地区、种族中表现出一定差异[3]。本研究旨在分析深圳市宝安区β-地中海贫血患者BCL11A基因rs4671393、rs766432位点单核苷酸多态性与HbF的相关性，以期为宝安区β-地中海贫血患者的个性化编辑治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月至2021年6月深圳市宝安区石岩人民医院收治的120例β-地中海贫血患者设为观察组，另选取同期院内100名健康体检者设对照组，进行回顾性分析。观察组患者中男性67例，女性53例；年龄22～46岁，平均年龄（37.58±6.46）岁；体质量指数（BMI）18～28 kg/m2， 平 均 BMI（23.41±3.26）kg/m2。对照组研究对象中男性54名，女性46名；年龄24～49岁，平均年龄（39.06±5.48）岁；BMI 18～28 kg/m2， 平 均 BMI（22.86±3.54）kg/m2。两组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），组间具有可比性。本研究经深圳市宝安区石岩人民医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①符合《重型β地中海贫血的诊断和治疗指南（2017年版）》[4]中β-地中海贫血的诊断标准；②血红蛋白＜60 g/L；③2周以上无羟基脲治疗史或输血史。排除标准：①合并多发性骨髓瘤、遗传性胎儿血红蛋白持续增高综合征等影响HbF的疾病；②合并明确诊断的恶性肿瘤；③合并严重精神或心理疾病无法配合研究。

1.2 研究方法 采集两组研究对象空腹静脉外周血2 mL，使用EDTA抗凝的采血管收集，存放于2～4 ℃环境下。采用法国SEBIA全自动毛细管电泳仪（深圳市科时达电子科技有限公司，型号：sebia capillarys 2 flex piercing）及配套试剂对标本进行血红蛋白电泳检测。全血基因组DNA提取，使用基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取基因组DNA，严格按照试剂盒步骤进行操作，将提取的基因组DNA置于-20 ℃冰箱中保存，并检测DNA浓度和纯度，纯度在1.6～1.9 μg范围内为合格。采用Primer和OligO 6.0软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成，其中rs4671393位点引物序 列 为：5’-GTGTTCGGAGTCCTAAGAGC-3’、5’-TGTCTAAGATGGCTGTCCTGT-3’，退火温度为60 ℃，产物大小为419 bp；rs766432位点引物序列为：5’-CCTGAAAGACGGCTAGAGTCT-3’、5’-GGCAAATTGAATCCAACTG-3’，退火温度为54 ℃，产物大小为172 bp。限制性内切酶的设计与合成：采用DNAssist2.0软件确定内切酶（加拿大Fermentas公司），rs4671393位点限制性内切酶：Eco57I.水浴温度37 ℃。酶切片段：GG型为419 bp，GA型为419 bp、169 bp、250 bp，AA型 169 bp、250 bp。使用 ABI-9700PCR扩增仪进行PCR扩增，步骤如下：PCR总反应体系为 25 μL，包括 10 μL 的 2×PCR mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL DNA模板，并以双蒸水补足为25 μL。在PCR仪中扩增，反应条件如下：94 ℃下预变性5 min，94 ℃下变形45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃终末延伸7 min。各反应体系只控制退火温度不同。将PCR产物置于4 ℃冰箱中保存，取5 μL PCR产物进行凝胶电泳。BCL11A目的基因rs4671393、rs766432位点多态性PCR限制性片段长度多态性分析：取5 μL PCR产物分别加入Fast 10×Buffer缓冲液（ThermoFisher）1 μL，0.5 μL限制性内切酶，3.5 μL去离子水，反应总体系为10 μL，混合均匀后以1 000 r/min速度离心数秒，放置于恒温水浴箱中约16 h，取10 μL酶切好的PCR产物加样到2.5%琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳。PCR扩增产物测序，验证酶切结果，使用测序仪ABI-PRISM3730仪器（美国应用生物系统公司，型号：PRISM3730）进行测序，测序试剂使用Big Dyeterminator v3.1。使用chromas软件读出测序结果后，与Gene Bank参照序列进行比较。

1.3 观察指标 ①比较两组研究对象rs4671393、rs766432位点基因型与等位基因频率。②比较两组研究对象rs766432位点基因型与等位基因频率。③分析BCL11A基因rs4671393、rs766432位点不同基因型与HbF的相关性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学软件处理数据。计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以[例(%)]表示，组间比较行χ2检验；采用Spearman检验分析rs4671393、rs766432位点不同基因型与HbF的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象rs4671393位点基因型与等位基因频率比较 观察组研究对象rs4671393位点AA基因型、A等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组研究对象rs4671393位点基因型与等位基因频率比较 [例(%)]

2.2 两组研究对象rs766432位点基因型与等位基因频率比较 观察组研究对象rs766432位点CC基因型、C等位基因频率较高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组研究对象rs766432位点基因型与等位基因频率比较 [例(%)]

2.3 BCL11A基 因rs4671393、rs766432位 点 不同基因型与HbF的相关性 经Spearman检验，BCL11A基因rs4671393、rs766432位点与HbF水平呈正相关（P＜0.05），见表3。

表3 BCL11A基因rs4671393、rs766432位点不同基因型与HbF的相关性

3 讨论

β-地中海贫血根据疾病严重程度可分为重、中、轻型，该病的症状具有较大的变异性，症状轻的患者可能与正常人无异，而重型β-地中海贫血由于β基因缺失或突变导致β链无法合成或合成不足，需要依赖输血维持生命[5]。近年有研究显示，肽链间的不平衡状态在HbF增加后得到有效改善，重型β-地中海贫血患者的临床表型也有所减轻，有利于降低患者死亡率[6]。因此，促进HbF增加、研究单核苷酸多态性的功能成为β-地中海贫血相关研究中的重要问题。由于基因多态性具有明显的种族和地域差异，因此在β-地中海贫血多发的地区进行基因多态性研究具有重要意义。

BCL11A基因是一种锌指结构转录阻遏物，活跃于B淋巴细胞，在红细胞中表达。BCL11A参与造血肿瘤的产生和正常淋巴细胞的发育，此外还是HbF主要的数量性状位点。研究显示，BCL11A基因表达减少，HbF水平随之提高，证明BCL11A基因对HbF具有负调控作用[7]。BCL11A影响HbF水平的主要功能序列位于BCL11A基因第2个内含子上rs1427407和rs4671393之间的功能区。这一区域中rs4671393位点、rs766432位点的多态性和HbF的相关性已在部分研究中证实，它不影响其编码，但可能通过组建新的剪切信号对正常转录造成影响，从而调节基因表达，减少BCL11A的基因表达，提高γ珠蛋白基因表达，促进HbF生成[8]。

本研究显示，rs4671393位点纯合子突变AA基因型有15例，rs766432位点纯合子突变CC基因型有37例。其中同时具有这两个位点的纯合突变的有9例；rs4671393位点、rs766432位点杂合突变分别有45例、12例，其中具有两个位点杂合突变的有8例。本研究对单纯rs4671393位点突变、单纯rs766432位点突变样本的基因型和HbF的相关性进行研究，结果显示，BCL11A基因rs4671393、rs766432位点与HbF水平具有相关性，相关系数分别为0.716、0.639，提示BCL11A基因rs4671393位点、rs766432位点的多态性可在一定程度上对HbF水平造成影响。此外，基因序列中rs4671393位点定位是60，493，816，而基因序列中rs766432位点定位为60，492，835，两者的位置比较接近，并且两个位点间高度连锁不平衡，两者的基因突变在功能上或许存在某些关联性或协同作用[9-10]。

综上，宝安地区人群存在BCL11A基因的rs4671393位点、rs766432位点多态性，该地区β-地中海贫血患者与健康人群的rs4671393位点、rs766432位点基因型、基因频率都有一定差异，并且rs4671393位点的G-A突变、rs766432位点的A-C突变可能促进HbF的合成。