骨质疏松性骨折与非骨质疏松性骨折患者肌肉病理状态及组蛋白甲基化的差异

王乾 孙攀 黄廷锐 黄晨 万宏波 赵永见,3 邬学群 王拥军,3 施杞,3 唐德志,3*

1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032 2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理论与治法重点实验室，上海 200032

骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是老年人群高发骨折之一，尤其高发老年女性群体，其中髋部骨折的危害最大，所以又被骨科医师形象地称为“人生最后一次骨折”[1]。OPF的发生除了自身骨形成和骨吸收代谢紊乱外，跌倒是重要诱因[2]。有报道显示，全球65岁以上老年人大约有35 %的比例会发生跌倒，而跌倒后发生骨折的概率更是接近15 %[3]。大量前瞻性研究更是证实肌少症的发生与老年人跌倒和骨折的发生成正相关，肌少症会引起骨骼肌功能的减退[4]。中医学将肌肉与骨骼关系的失衡的现象称之为“骨肉不相亲”理论[5]，在论述治疗骨折时强调筋骨并重，治疗骨折的同时注重局部软组织的保护。但是目前对于OPF患者肌肉病理状态研究还不够透彻，详细了解OPF患者和非OPF患者肌肉病理状态有助于我们深刻认知OPF这种疾病。

组蛋白甲基化修饰作为组蛋白密码的重要组成部分，深刻影响着表观遗传学的调控，是目前表观遗传学研究的热点之一[6]。SUV39H1是组蛋白甲基化酶，通过对染色质结构疏松紧密状态的调控影响着目的基因的转录或沉默[7]。研究[8]发现SUV39H1可通过调控MYOD或辅助因子MEF2C调控抑制C2C12细胞的成肌分化。那么SUV39H1是否同样会抑制OPF患者肌干细胞成骨分化呢？这需要对OPF患者肌肉的组蛋白甲基化情况进行研究，而目前OPF患者与非OPF患者肌肉的组蛋白甲基化情况尚不明确。故本实验将OPF患者肌肉与非OPF患者肌肉进行病理染色和RT-qPCR检测，旨在探究OPF患者与非OPF患者肌肉病理状态及组蛋白甲基化情况差异，从而为为OPF的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 一般资料

于2021年11月至2022年1月在上海中医大学附属龙华医院骨伤科住院部分别招募6例OPF患者和非OPF患者。其中OPF组患者男性2例，女性4例。年龄 67～80岁，平均(73.2±5.4)岁；体重为42～75 kg，平均体重为(58.49±8.76)kg；受伤部位：左侧 3例，右侧3例；骨折类型：股骨粗隆间骨折3例，肱骨干骨折2例，桡骨远端骨折1例。非OPF组患者男性2例，女性4例。年龄 35～60岁，平均(42.6±6.0)岁；体重42～75 kg，平均(58.97±9.27)kg；受伤部位：左侧3 例，右侧 3例。骨折类型：股骨颈骨折1例，胫骨干骨折2例，腓骨骨折1例，盖氏骨折2例。标本获取前已征得患者同意，并签订知情同意书。本研究已通过上海中医药大学附属龙华医院伦理委员会审核批准(伦理批件号：2020LCSY087号)。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1纳入标准：OPF患者纳入标准：①60岁≤年龄<80岁的男性、女性患者；②有车祸、扭伤或跌伤等外伤史；③临床症状及体征：患侧肢体压痛、纵向叩击痛呈现阳性，患肢可扪及骨擦音或骨擦感或不明显，患肢多数有畸形。④影像学表现：X线或CT显示明显骨折征象；双能X线显示骨质疏松(T≤-2.5)；⑤可耐受内固定手术患者。非OPF患者纳入标准：①30岁≤年龄<60岁的男性、女性患者；②有车祸、扭伤或跌伤等外伤史；③临床症状及体征：患侧肢体压痛、纵向叩击痛呈现阳性，患肢可扪及骨擦音或骨擦感或不明显，患肢多数有畸形。④影像学表现：X线或CT显示明显骨折征象；双能X线显示骨量正常(T值≥-1.0 )；⑤可耐受内固定手术患者。

1.2.2排除标准：不符合上述OPF患者和非OPF患者纳入标准者；开放性骨折有软组织缺损或感染者；体质较差难以进行手术者；不愿意参加此研究者。

1.3 实验标本

实验所需OPF患者肌肉标本和非OPF患者肌肉标本均来自上海中医大学附属龙华医院骨伤科，患者骨折手术内固定时同时切取少量患侧肌肉作为实验标本。

1.4 主要试剂与仪器

H3K9me3、H3K9Ac抗体购自英国Abcam公司；HE试剂盒、柠檬酸钠抗原修复液(50×)均购自上海碧云天有限公司；MASSON试剂盒购自北京索莱宝有限公司；Tissure RNA Purification kit plus 、Color Reverse Transcription kit、2×Color SYBR Green qpcr master mix均购自美国 EZBioscience公司；兔二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自中杉金桥；PCR引物由华大基因生物有限公司合成，具体引物序列见表1。Histobath 摊片机、Histoplate 烘片机、轮转式切片机、全自动石蜡包埋机、自动脱水机均采购德国Leica公司；BX51、BX42正置荧光显微镜日本Olympus公司。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.5 标本获取后处理

肌肉标本在无菌手术室获取出以后，分成两块：一块立即放入液氮罐中保存；另一块放入10 %的中性福尔马林中固定，固定24 h以后流水冲洗3 h，随后放入脱水机常规脱水，后续进行石蜡包埋、切片。

1.6 实验方法

1.6.1HE染色：标本 60 ℃烤箱 30 min，脱蜡至水；苏木精染液 2 min，后蒸馏水冲洗 1 min，盐酸乙醇分化 5 s；氨水返蓝 15 s，后蒸馏水冲洗 1 min，伊红染液 2 min；蒸馏水冲洗 1 min，乙醇分化，二甲苯透明后树胶封片。

1.6.2MASSON染色：标本60 ℃烤箱 30 min，脱蜡至水；Weigert 铁苏木精染色10 min，酸性乙醇分化10 s，水洗；Masson 蓝花液返蓝4 min，水洗，蒸馏水洗1 min；丽春红品红染色液染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷钼酸洗2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色液浸染2 min，弱酸工作液洗1 min，95 %乙醇快速脱水；无水乙醇脱水3次，每次30 s；二甲苯透明3次，每次1 min，中性树胶封片。

1.6.3实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)：从液氮罐中取出肌肉标本，根据EZBioscience 总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，测定RNA浓度并监测提取RNA的质量是否符合进行下一步反转录的要求。将符合要求的RNA按照1 μg/20 μL 的体系采用EZBioscience反转录试剂盒将其反转录成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参，按照EZBioscience实时荧光定量检测试剂盒说明书进行扩增。采用2-△△ct法计算SUV39H1过表达稳转株RUNX2、ALP、OPN、OCN、MYOD的mRNA相对表达量水平。表1为扩增所需引物，PCR反应条件为：第1步，95 ℃ 5 min；第2步，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环。

1.6.4免疫组化染色：标本 60 ℃烤箱 30 min，脱蜡至水；标本放入稀释至1×的柠檬酸钠抗原修复液中，微波炉适当时间抗原修复；加入适量内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS水洗3 min 3次；滴加适量一抗(H3K9me3、H3K9Ac)，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3 min空3次；滴加适量反应增强液，室温孵育20 min，PBS冲洗3 min 3次；滴加适量新鲜配置的DAB显色液，室温孵育5 min；自来水冲洗，苏木精染色液孵育20 s，盐酸乙醇分化，冲洗返蓝；梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 肌肉HE染色检测结果

对两组患者骨折部位肌肉的横断面和纵切面HE染色，可发现非OPF患者的肌肉更加紧实，OPF患者的肌肉较松弛。表明OPF患者易产生肌无力而跌倒。见图1。

图1 两组患者肌肉横切面(左)与纵切面(右)HE染色Fig.1 HE staining of transverse (left) and longitudinal (right) sections of muscle in both groups

2.2 肌肉MASSON染色检测结果

对两组患者骨折部位肌肉的横断面和纵切面MASSON染色，观察胶原纤维在肌肉内部的分布，可发现OPF患者的肌肉胶原纤维分布多于非OPF患者，这可能是OPF患者肌力下降的原因。

2.3 肌肉RT-qPCR检测结果

通过实施定量PCR，我们检测了OPF患者和非OPF患者骨折部位肌肉SUV39H1基因，检测结果发现OPF患者骨折部位肌肉SUV39H1表达水平较非OPF患者高，差异具有统计学意义。

图2 两组患者肌肉横切面(左)与纵切面(右)MASSON染色Fig.2 MASSON staining of transverse (left) and longitudinal (right) sections of muscle in two groups of patients

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.4 骨折断端肌肉H3K9Ac免疫组化染色检测结果

对两组患者骨折部位肌肉H3K9Ac免疫组化染色显示，非OPF患者骨折部位肌肉H3K9Ac表达高于OPF患者，说明OPF患者肌肉组蛋白乙酰化水平较低。

图4 两组患者肌肉H3K9Ac免疫组化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of muscle H3K9Ac in two groups of patients

2.5 骨折断端肌肉H3K9me3免疫组化染色检测结果

对两组患者骨折部位肌肉H3K9me3免疫组化染色显示，OPF患者骨折部位肌肉H3K9me3表达高于非OPF患者，说明OPF患者OPF患者肌肉组蛋白甲基化水平较高。

图5 两组患者肌肉H3K9me3免疫组化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of muscle H3K9me3 in two groups of patients

3 讨论

OPF是一种增龄性病理骨折，老年人是其易感人群。OPF的发生极其隐匿，呈渐进性进展，很容易被大家忽视，直至患者出现骨折结局，因此造成的危害极大。由于我国作为最大的老龄化国家，OPF人群基数庞大，该病的治疗已引起社会广泛关注[9]。目前针对OPF的治疗主要是手术为主，外加抗骨质疏松药物治疗。临床上抗骨质疏松的药物根据其作用机制主要分为3类：促进骨形成药物、抑制骨吸收药物及介于二者之间的多靶点药物。钙剂、维生素D及双膦酸盐类药物是目前治疗OP的临床一线药物，早期合理的联合应用可有效改善骨质疏松状况，降低OPF发生的风险。但是长期服药引起的不良反应如胃肠道不良反应、下颌骨坏死，增加乳腺癌、血栓等患病风险，一定程度上限制了其临床应用[10-11]。纵观OPF的诊疗，人们往往把治疗的重心放在骨上，而对肌肉的关注程度还远远不够。

大数据分析显示，OPF的发生常合并众多疾病，而肌少症是值得我们关注的焦点[12]。肌肉和骨骼解剖上毗邻，功能上互为影响。肌少症引起的肌肉质量下降是跌倒发生的易感因素，而跌倒又是OPF发生的直接诱因。对于肌肉和骨病理层面的探究，中医典籍中早有论述。《素问·痿论》指出：“脾气热，则胃干而渴，肌肉不仁，发为肉痿；肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”，揭示了痿证的治疗时应注重调控脾肾及脾胃，丰富了痿证的治疗理论[13]。中医学治疗骨折更是强调筋骨同治，在注重骨折治疗的同时加强肌肉、肌腱、筋脉的保护[14]。本研究通过对OPF和非OPF患者骨折部位肌肉进行HE染色、MASSON染色发现OPF患者肌肉较非OPF患者肌肉质地更加松弛，胶原纤维含量明显增多。这一发现进一步阐明了OPF患者肌力下降的原因，加深了对OPF疾病的认识，同时也告诫我们在平时OPF的诊疗过程中要加强对肌少症的调护，管理的时间点也不应局限在治疗时，而应重视平时的干预。“骨肉不相亲”是OPF发生的重要诱因，因此在OPF的防治中，加强对肌肉的调护是未来OPF治疗的一个发展方向。

组蛋白甲基化作为表观遗传修饰的一种，一般是指发生在H3或H4组蛋白氨基端残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases, HMTs)催化，作用是改变目的基因的转录调控[15]。组蛋白甲基化对基因转录程度的调控主要受发生甲基化的位点以及结合甲基数目决定[16]。SUV39H1属于赖氨酸甲基转移酶家族的一员 ，主要通过催化第九位的赖氨酸残基位点，发挥表观遗传修饰功能。对于组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HKMT)，通常认为H3K9的乙酰化可以促进目的基因的转录，H3K9的甲基化对基因的转录的起抑制作用，并且H3K9的三甲基化是难以去除的[17]。目前针对SUV39H1的研究大多集中在肿瘤领域，相关研究显示SUV39H1参与众多肿瘤的发生发展及转归[18-19]。对于OPF患者肌肉组蛋白甲基化状态的研究相对匮乏。本研究我们通过RT-qPCR发现OPF患者肌肉SUV39H1基因相对表达量较非OPF患者高(P<0.001)。我们进一步对OPF患者和非OPF患者肌肉进行免疫组化染色发现OPF患者较非OPF患者肌肉H3K9me3甲基化程度高、H3K9Ac乙酰化程度低。这一发现进一步丰富OPF患者表观遗传学理论，为我们后期治疗提高了新思路。

综上所述，本研究表明与非OPF患者肌肉相比，OPF患者肌肉更加松弛，胶原纤维含量增高，而这可能是由于肌肉组蛋白甲基化程度升高，乙酰化降低造成的。本研究以OPF患者肌肉与组蛋白甲基化的联系为切入点，这为OPF的治疗提供了相关实验数据和理论支持，也提供了新的思路与方法。但是由于本实验存在样本量少，组蛋白甲基化与肌肉病理直接机制尚未阐明，还需要后续实验进一步验证和完善。