金天格胶囊对H2O2诱导的小鼠成骨细胞MC3T3-E1氧化应激损伤及炎症因子的作用

李超 赵剑波* 陈俊雅 耿玲 何宁 赵浩东

1. 大理大学第一附属医院创伤骨科，云南 大理 671000； 2. 大理大学，云南 大理，671000

骨质疏松(osteoporosis，OP)是常见老年疾病，致残率高。临床以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病[1]。而由于OP产生的病理性骨折，是老年人死亡的重要因素。流行病学研究[2]表明，OP与多种因素有关，包括遗传因素、钙和维生素D缺乏、雌激素和雄激素分泌不足、老年退化性机制等。现代药理研究[3]表明，在骨质疏松的发生发展中，氧化应激是一个至关重要的初始风险因素。活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)积累和成骨细胞凋亡参与了各种类型OP的发病机理，因此抗氧化在一定程度上能够预防骨质疏松。

金天格胶囊为人工虎骨粉，具有健骨作用，临床前研究及临床研究均发现其具有一定的促进骨生长的作用[4]，但是对于氧化应激所导致的损伤作用尚不清楚。因此，本研究利用小鼠成骨细胞ME3T3-E1，考察过氧化氢(H2O2)刺激后氧化还原平衡和炎症基因、炎症因子变化，并同时考察金天格胶囊对氧化应激损伤的保护作用，对细胞中总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活力的影响，以及对肿瘤坏死因子alpha(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素1beta(interleukin 1 beta，IL-1β)、白介素6(interleukin 6，IL-6)基因表达和细胞因子分泌的影响，从而明确金天格胶囊对氧化应激损伤的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞株

小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞株(北纳创联生物技术有限公司，中国)，采用含10 %胎牛血清，1 %青-链霉素的MEM-α(modified eagle medium-α)完全培养基，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养。

1.2 药品与试剂

金天格胶囊，由金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂馈赠。药物配制：取1.2 g(0.4 g ×3粒)金天格胶囊，无菌条件下用12 mL MEM-α完全培养基溶解，0.22 μm过滤器过滤，即得100 mg/mL金天格胶囊储备液，4 ℃保存。临用前用MEM-α完全培养基分别配制成100、50、20、10、0 μg/mL金天格胶囊溶液。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自碧云天生物技术研究所，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒以及扩增试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。小鼠Ⅰ型前胶原羧基端前肽(procollagen type ⅠC-peptide，PICP)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒和小鼠碱性磷脂酶(alkaline phospholipase，ALP)ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。小鼠TNF-α ELISA试剂盒、IL-1β ELSA试剂盒、IL-6 ELSA试剂盒，SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒、CAT检测试剂盒和CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂均购自碧云天生物技术研究所。青-链霉素混合液(100×)和胰酶购自北京索莱宝科技有限公司，MEM-α培养基购自美国HyClone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 仪器

RT-PCR仪(美国BIO-RAD公司)，多功能酶标仪(美国基因有限公司)，NanoPhotometer(德国Implen公司)，实时荧光定量PCR仪(Life Technologies)。

1.4 细胞培养

MC3T3-E1细胞培养于含10 %胎牛血清、1 %青-链霉素混合液的EME-α完全培养基中，置于37 ℃、5 % CO2的培养箱中培养观察。

1.5 金天格胶囊对ME3T3-E1细胞增殖、凋亡及ALP、PICP含量影响的测定

1.5.1CCK-8检测细胞增殖：将100 μL浓度为1×105/mL细胞悬液接种于96孔细胞培养板，分别设为不同浓度金天格胶囊组(100、50、20、10、0 μg/mL金天格胶囊溶液)，空白组加入同体积无血清培养基，每组设6个复孔，置37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱培养。24 h后，去除培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer sulfate，PBS)轻轻洗2次，相应孔中分别加入不同浓度的金天格胶囊溶液或无血清培养基，继续置37 ℃、含5 % CO2的细胞培养箱培养。24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，置37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱培养。避光孵育3 h后，采用酶标仪于450 nm处测定吸光度值。

1.5.2ELISA检测细胞培养上清中相关因子：将MC3T3-E1细胞以1×106/mL接种于6孔细胞培养板。培养24 h后，吸弃细胞培养上清液，药物组分别加入含不同浓度金天格胶囊(100、50、20、10、0 μg/mL)的完全培养基，空白组加入同体积无血清培养基，48 h后，收集细胞培养上清液，3 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集、分装上清，-20 ℃保存备用。根据ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清液中ALP和PICP含量。

1.6 金天格胶囊对H2O2诱导ME3T3-E1细胞损伤保护作用的测定

1.6.1H2O2损伤模型制备及药物作用下细胞增殖活力测定[5]：按照MC3T3-E1细胞数量和体积种板。24 h后，吸弃细胞培养上清。药物组分别加入不同浓度金天格胶囊(100、50、20、10、0 μg/mL)的完全培养基，空白组加入同体积无血清培养基。20 h后，药物组和损伤组均加入含1 mmol/L H2O2的MEM-α完全培养基共孵育4 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，避光孵育3 h后，采用酶标仪于450 nm处测定吸光度值。

1.6.2细胞中SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力测定：以1×105/mL细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，24 h后，吸弃细胞培养上清液。药物组分别加入不同浓度金天格胶囊(100、50、20、10、0 μg/mL)的完全培养基，空白组加入同体积无血清培养基。20 h后，药物组和损伤组均加入含1 mmol/L H2O2的MEM-α完全培养基共孵育4 h后，按照试剂盒说明书测定细胞中SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力。

1.6.3细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定：按照1×106/mL将MC3T3-E1细胞接种于6孔板中。按照细胞种板及给药方法，加H2O2孵育4 h后，收集细胞培养上清液，3 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集、分装上清，-20 ℃保存备用。根据ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.6.4细胞中Tnfa、Il-1b、Il-6相对mRNA水平测定按照1×106/mL将MC3T3-E1细胞接种于6孔板中。按照细胞种板及给药方法，加H2O2孵育4 h后，吸弃细胞培养上清液，PBS轻轻洗1次，收集每孔细胞。采用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。然后扩增cDNA进行RT-PCR。实验采用GAPDH作为内参基因，结果采用2-△△CT法进行分析。RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，具体引物序列如下：Tnfa5’-3，F：CCCTCACACTCAGATC ATCTTCT，R：GCTACGACGTGGGCTACAG；Il-1b5’-3’，F：GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，R：ATCTTT TGGGGTCCGTCAACT；Il-6 5’-3’，F：TAGTCCTT CCTACCCCAATTTCC，R：TTGGTCCTTAGCCACTCC TTC；GAPDH 5’-3，F：AGGTCGGTGTGAACGGAT TTG，R：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度金天格胶囊作用24 h对MC3T3-E1细胞增殖的作用

与空白组比较，20、50、100 μg/mL金天格胶囊溶液均能够促进MC3T3-E1细胞增殖，其中100 μg/mL金天格胶囊溶液能显著促进MC3T3-E1细胞增殖(P<0.01)。结果见图1。

注：与空白组比较，**P < 0.01。

2.2 不同浓度金天格胶囊对MC3T3-E1细胞培养上清中ALP和PICP含量的影响

与空白组比较，除10 μg/mL金天格胶囊溶液外，20、50、100 μg/mL金天格胶囊溶液均可明显提高MC3T3-E1细胞培养上清中ALP和PICP含量，且差异具有统计学意义(P< 0.05，P< 0.01)。结果见表1。

表1 金天格胶囊提高MC3T3-E1细胞培养上清中ALP和PICP含量

2.3 H2O2诱导下细胞增殖活力测定

与空白组比较，H2O2组MC3T3-E1细胞存活率显著下降(P< 0.01)，10、20、50 μg/mL金天格胶囊溶液组细胞存活率也明显下降(P< 0.01)。与H2O2组比较，50、100 μg/mL金天格胶囊溶液能显著提高H2O2刺激后的细胞存活率(P< 0.01)。结果见图2。

注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与H2O2组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。

2.4 H2O2诱导下SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力测定

与空白组比较，H2O2组MC3T3-E1细胞中SOD、CAT活力显著降低(P< 0.01)，MDA水平显著上升(P< 0.01)、GSH-Px水平明显下降(P< 0.05)。与H2O2组比较，100 μg/mL金天格胶囊溶液能显著提高SOD、CAT活力(P< 0.01)，提高GSH-Px水平(P< 0.05)，显著降低MDA水平(P< 0.01)。结果见表2。

表2 H2O2诱导下不同浓度金天格胶囊溶液对MC3T3-E1细胞中SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力影响

2.5 H2O2诱导下细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定

与空白组比较，H2O2组MC3T3-E1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著提高(P< 0.01)，10、20、50 μg/mL金天格胶囊溶液组细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量也明显提高(P< 0.05，P< 0.01)。与H2O2组比较，50、100 μg/mL金天格胶囊溶液能明显降低MC3T3-E1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P< 0.05，P< 0.01)。结果见表3。

表3 H2O2诱导下不同浓度金天格胶囊溶液对MC3T3-E1细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量作用

2.6 H2O2诱导下细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达

与空白组比较，H2O2组和10 μg/mL金天格胶囊溶液组细胞中Tnfa、Il-1b和Il-6 mRNA相对表达明显提高(P< 0.05，P< 0.01)。与H2O2组比较，50、100 μg/mL金天格胶囊溶液组能显著降低细胞中Tnfa和Il-6 mRNA相对表达(P< 0.01)。结果见表4。

表4 H2O2诱导下不同浓度金天格胶囊溶液对MC3T3-E1细胞中Tnfa、Il-1b和Il-6 mRNA相对表达

3 讨论

目前，世界上约有2亿人正在遭受OP困扰，而受环境和生活方式等多种因素影响，这一数据还在不断增加[6]。氧化应激被认为是许多疾病状态的致病因素之一，包括降低骨密度，即骨量流失[7]。研究表明，抗氧化剂可以作为OP治疗的有效手段之一，并且多种抗氧化剂的抗氧化应激作用，如N-乙酰半胱氨酸[8]、绿原酸[9]等，已经得到临床前证明。H2O2体外诱导MC3T3-E1细胞损伤模型，是在成骨细胞中建立骨坏死的常用体外模型。在此模型中，H2O2促进MC3T3-E1细胞凋亡[10]，诱导氧化应激，从而增加过氧化产物MDA水平，下调GSH-Px水平[11]。结果发现，100 μg/mL金天格胶囊溶液能显著促进正常MC3T3-E1细胞的增殖，并显著提高H2O2诱导MC3T3-E1细胞存活率的下降。同时，100 μg/mL金天格胶囊溶液显著提高了抗氧化相关因子SOD、CAT活力，提高GSH-Px水平，并降低过氧化产物MDA水平。说明金天格胶囊对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞氧化应激损伤具有保护作用。

研究发现，在MC3T3-E1细胞中，H2O2诱导了炎症因子TNF-α、IL-1β等水平的增加[12]。临床研究也发现，金天格胶囊与阿法骨化醇软胶囊联用，对绝经后骨质疏松症具有较好疗效，可减少血液中炎症因子水平[13]。结果发现，金天格胶囊溶液能降低MC3T3-E1细胞中Tnfa、Il-6、Il-1b基因相对表达，减少细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。结果表明，金天格胶囊具有明显的抗炎作用。

骨质疏松(OP)以骨量流失为特征，通常伴随着骨吸收增加和骨形成减少的发生。骨的形成与成骨细胞活性有关，碱性磷脂酶(ALP)活性反映了成骨细胞分化程度，其活性越高，成骨细胞的成骨活性越强[14]。I型胶原蛋白约占骨骼有机成分的90 %，骨形成时，Ⅰ型前胶原羧基端前肽(PICP)会随I型胶原的合成而释放入血，其水平能反映骨细胞合成骨胶原的能力[15]。实验结果发现，在体外培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞株中，除10 μg/mL金天格胶囊溶液之外，20、50、100 μg/mL金天格胶囊溶液均可显著提高MC3T3-E1细胞培养上清中ALP和PICP含量(P< 0.05，P< 0.01)。表明金天格胶囊增强了成骨细胞活性和I型胶原合成能力。

在中成药治疗膝骨关节炎临床应用指南(2020年)中，明确指出金天格胶囊可以用于膝骨关节炎的缓解期和康复期[16]。本研究表明，金天格胶囊能显著促进小鼠MC3T3-E1正常成骨细胞增殖，并提高H2O2引起的细胞存活率的降低；降低炎症因子水平；此外，金天格胶囊还能增强成骨细胞活性和I型胶原合成能力。因此，抗氧化应激、抗炎和促进I型胶原合成在金天格胶囊治疗OP的过程中可能发挥重要作用。

本研究着重考察了金天格胶囊在OP体外模型中对氧化应激的调节作用，对炎症因子在RNA和蛋白水平表达增加的抑制作用，提高ALP和PICP增强成骨细胞活性作用。但是，还需要明确在OP临床样本和动物模型的不同发病时间和发展阶段，其氧化应激和炎症应答各因子水平变化，以及成骨细胞和破骨细胞之间的平衡，进一步探究其可能的发病机制，并探讨金天格胶囊对OP不同阶段的作用。