紫云英苷对膝关节骨性关节炎大鼠JNK/p38 MAPK信号通路的影响

杨博辰 付学敬 朱琳

河南中医药大学第三附属医院骨伤科，河南 郑州 450000

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是临床上常见的一种慢性、退行性骨关节疾病，主要病理特征为骨质疏松、滑膜炎症以及软骨退化变性、软骨细胞凋亡等[1]，研究[2]表明KOA发病率与致残率随全球老龄化程度加深，呈上升趋势，严重威胁人们的生命健康以及生活质量。KOA发病机制复杂，遗传、创伤、肥胖以及年龄等都能够导致KOA的发生[3]。目前相关研究[4]认为炎症反应以及软骨重建异常等在KOA的发生发展中起着关键作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路包括ERK、c-Jun-N末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase, JNK)以及p38 MAPK信号通路，其能够参与调控炎症反应、氧化应激、细胞分化与凋亡等多种生理病理过程[5-6]，但JNK/p38 MAPK信号通路对软骨重建的影响尚不清晰。紫云英苷是一种黄酮类化合物，是中药杜仲的主要活性成分，具有神经保护、抗菌、抗炎以及抗氧化作用，目前紫云英苷临床上被用于多种疾病的治疗[7]。研究[8]表明，紫云英苷能够抑制胶原纤维形成，改善小鼠关节炎以及抑制滑膜细胞的炎症反应和骨破坏。本研究通过建立KOA模型，探究紫云英苷对KOA大鼠的保护作用以及对JNK/p38 MAPK信号通路的影响，为临床治疗KOA提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：90只SD雌性大鼠，6周龄，体质量(180±20)g，购于北京科宇动物养殖中心，许可证号为SCXK(京)2018-0010。

1.1.2实验药物与试剂：紫云英苷(YRZ019, 成都仪睿生物科技有限公司)；塞来昔布(B14201006862, 辉瑞制药有限公司)；IL-1β(SP12225)、IL-6(SP12279)、TNF-α(SP12250)ELISA试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)；HE染色试剂盒(G1120, 北京索莱宝生物技术有限公司)；TGF-β1 ELISA试剂盒(ER013-96, 上海依科赛生物科技有限公司)；MMP-3 ELISA试剂盒(ER1164, 武汉菲恩生物科技有限公司)；p-JNK(ab124956)、JNK(ab179461)、p-p38 MAPK(ab4822)、p38 MAPK(ab170099)一抗、羊抗兔IgG(HRP, ab205718)(英国Abcam公司)。

1.1.3实验仪器：游标卡尺(上海辅泽商贸有限公司)；PV-200足趾容积仪(成都泰盟软件有限公司)；NB2000生物显微镜(南京先纳光学仪器有限公司)；QuickGel 6100凝胶成像系统(北京必吉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立与分组给药：90只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、塞来昔布组、紫云英苷低、中、高剂量组，每组15只。参照文献[9]采用改良Huith法建立KOA模型：麻醉大鼠，仰卧位固定备皮，消毒后在右侧膝关节髌骨旁内侧开一2 cm左右小口，暴露关节腔，将膝关节前交叉、内侧副韧带依次剪断，摘除半月板，清洗消毒后逐层缝合，注意造模过程中不要伤及其他组织与软骨。假手术组仅打开关节腔，不做上述处理。术后连续1周注射青霉素，之后开始驱赶大鼠活动，驱赶4周后开始给药。塞来昔布组灌胃18 mg/kg塞来昔布胶囊水溶液[10]，紫云英苷低、中、高剂量组分别灌胃25、50、100 mg/kg紫云英苷[11]，每日1次，连续灌胃6周。模型组与假手术组给予相同剂量的蒸馏水。

1.2.2各组大鼠膝关节直径及足趾容积的测量：给药结束后用游标卡尺对大鼠膝关节直径进行测量；运用足趾容积仪对大鼠足趾容积进行测量。每个指标测量3次，取平均值作为最终结果。

1.2.3各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的检测：实验结束后麻醉大鼠，取尾静脉血约2 mL，离心分离血清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4各组大鼠膝关节软骨组织病理变化的观察：每组取5只大鼠，处死后分离膝关节软骨组织，置于4 %多聚甲醛中固定，采用15 % EDTA溶液进行脱钙处理，脱钙3周后经常规脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、透明等操作后，采用HE染色，光镜下观察组织病理学变化。

1.2.5各组大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平的检测：每组取5只大鼠，处死后取膝关节软骨组织制备组织匀浆备用。按照试剂盒说明书操作检测各组大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平。

1.2.6各组大鼠软骨组织中JNK/p38 MAPK信号通路相关蛋白的表达：处死剩余大鼠分离膝关节软骨组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度，取30 μg蛋白上样进行电泳、转膜；加入5 %脱脂牛奶封闭1 h，清洗后加入p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK一抗，4 ℃孵育过夜，清洗后加入二抗，室温孵育2 h，清洗后采用ECL发光液显色，凝胶成像系统拍照，以β-actin为内参，分析条带灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 紫云英苷对KOA大鼠膝关节直径与足趾容积的影响

与假手术组比较，模型组大鼠膝关节直径与足趾容积明显变大(P<0.05)；与模型组比较，塞来昔布组与紫云英苷各剂量组大鼠膝关节直径与足趾容明显缩小(P<0.05)，紫云英苷各剂量组间具有剂量效应(P<0.05)，紫云英苷高剂量组与塞来昔布组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图1。

图1 各组大鼠膝关节直径与足趾容积的比较(*P<0.05)Fig.1 Comparison of knee joint diameter and toe volume of rats in each group (*P<0.05)

2.2 紫云英苷对KOA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，塞来昔布组与紫云英苷各剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.05)，紫云英苷各剂量组间具有剂量效应(P<0.05)；与塞来昔布组比较，紫云英高剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图2。

图2 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的比较(*P<0.05)Fig.2 Comparison of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α contents among all groups (*P<0.05)

2.3 紫云英苷对KOA大鼠膝关节软骨组织病理变化的影响

HE染色结果显示，假手术组大鼠软骨细胞形态正常、排列有序，细胞核完整，未见病变；模型组大鼠软骨组织表面被破坏，组织层变薄，细胞数量减少且排列紊乱，潮线被大量破坏；与模型组比较，塞来昔布组与紫云英苷各剂量组软骨细胞数量增加，组织层增厚，部分潮线被破坏，软骨组织表面逐渐恢复。紫云英苷各剂量组随着剂量增加，软骨组织病变逐渐减轻。结果见图3。

图3 各组大鼠膝关节软骨组织病理变化(HE, 400×)Fig.3 Pathological changes of knee cartilage in each group (HE, 400×)

2.4 紫云英苷对KOA大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，塞来昔布组与紫云英苷各剂量组大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平显著降低(P<0.05)；紫云英苷各剂量组间具有剂量效应(P<0.05)，紫云英苷高剂量组与塞来昔布组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图4。

图4 各组大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3含量的比较(*P<0.05)Fig.4 Comparison of TGF-β1 and MMP-3 contents in cartilage tissues of rats in each group (*P<0.05)

2.5 紫云英苷对KOA大鼠软骨组织中JNK/p38 MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值显著升高(P<0.05)；与模型组比较，塞来昔布组与紫云英苷各剂量组大鼠软骨组织中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值显著降低(P<0.05)；随着紫云英苷剂量增加，上述指标逐渐降低(P<0.05)，紫云英苷高剂量组与塞来昔布组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图5。

图5 各组大鼠软骨组织中JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达(*P<0.05)Fig.5 Protein expressions of JNK, P-JNK, p38MAPK and P-P38MAPK in cartilage tissues of rats in each group (*P<0.05)

3 讨论

KOA多发于中老年，因其较高的发病率与致残率受到了国内外医学界的广泛关注，目前临床上对于KOA的治疗效果不够理想，因此寻找更有效的KOA防治手段成为近年来的研究热点。越来越多的研究[12-13]证实，KOA主要病理表现为关节软骨进行性退变，由于关节磨损导致软骨细胞分化异常，引起炎性因子分泌过多，诱导关节软骨组织以及血液中炎症反应过度。本研究结果显示，KOA模型大鼠软骨组织表面被破坏，组织层变薄，细胞数量减少且排列紊乱，潮线被大量破坏，大鼠膝关节直径与足趾容积变大，提示KOA模型建立成功，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，提示炎症反应持续发生，诱导膝关节软骨退变。另外研究[14]发现，MMPs能够通过刺激软骨细胞外基质蛋白分解酶表达，促进软骨代谢，加重KOA损伤。TGF-β1在KOA的发生发展中也起到加速降解软骨细胞外基质蛋白降解的功能，诱导单核细胞和成纤维细胞分化，在KOA中发挥关键作用[15]。这与本研究结果一致，KOA大鼠软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平升高，提示KOA大鼠体内发生炎症反应，软骨细胞外基质蛋白被分解，软骨重建受阻，KOA损伤加剧。

中药价格低廉、不良反应小，在KOA的治疗中具有明显的优势，紫云英苷作为一类黄酮类化合物，具有广泛的药理活性，对于多种疾病均具有理想的治疗效果[16]，在炎症反应、氧化应激以及组织纤维化过程中发挥重要的药理特性[17-18]，其能够显著抑制炎性因子释放，减轻细胞凋亡。本研究中，低、中、高剂量紫云英苷干预后的KOA大鼠软骨组织受损减轻，大鼠膝关节直径与足趾容积缩小；血清中炎性因子水平以及软骨组织中TGF-β1、MMP-3水平逐渐降低，表明紫云英苷能够有效改善KOA大鼠软骨细胞损伤，减轻炎症反应，促进润谷重建，保护KOA大鼠软骨组织。塞来昔布是临床上缓解骨关节炎、治疗急性疼痛的一种口服药[19]，本研究中塞来昔布作为紫云英苷的阳性药物，表明紫云英苷在治疗KOA中与其效果一致。

MAPK蛋白家族在细胞中通过调控多种基因转录和蛋白表达，参与细胞分化、增殖与凋亡等生理病理过程[20]。JNK是MAPK蛋白家族的一员，在细胞中参与炎性反应、氧化应激以及免疫平衡等[21]。研究[22]表明，JNK与p38 MAPK在KOA的发生与发展中发挥重要作用。本研究结果显示，KOA模型大鼠软骨组织中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值升高，提示JNK/p38 MAPK通路被激活，软骨组织损伤加重。而不同剂量紫云英苷干预后KOA大鼠软骨组织中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值降低，说明紫云英苷能够下调JNK、p38 MAPK磷酸化蛋白表达，抑制JNK/p38 MAPK通路激活，从而改善KOA大鼠软骨组织损伤。

综上所述，紫云英苷改善软骨组织病变，抑制炎症反应，促进软骨重建，发挥KOA大鼠保护作用，可能与抑制JNK/p38 MAPK通路激活有关。紫云英苷对于临床治疗KOA具有潜在的可能性，但由于其在KOA中的应用仍处于探索阶段，具体机制还需要进一步深入研究。