基因表达谱芯片分析续苓健骨方治疗去卵巢大鼠骨质疏松症的基因表达差异

黄景文 李生强 陈玄 谢丽华 陈赛楠 黄小彬 葛继荣

福建省中医药科学院，福建 福州 350001

中医学认为骨质疏松症(osteoporosis，OP)与肾精亏虚、脾气虚弱有相当密切的关系[1-2]，因此中医理论指导下，课题组选用续苓健骨方来治疗骨质疏松症。本方主要出自于《中医伤科学讲义》续骨活血汤和《古今医鉴》清热调血汤，具有补肾壮骨、健脾益气、活血止痛的功效，其临床疗效明确[3]，前期研究已确定部分机制[4-6]，但主要作用机制尚不明确。因此，课题组通过对OP大鼠模型进行体内研究，利用基因表达谱芯片筛选各组间差异表达基因，寻找相关的作用靶点和信号通路，为续苓健骨方治疗OP提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠15只，6月龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养于福建省中医药科学院比较医学实验中心，合格证号：SYXK(闽)2009-000。

1.2 药品与试剂

续苓健骨方由 12 味中药组成(续断、白术、红花、陈皮、赤芍等)，购自福建省鹭燕医药有限公司，传统方法熬制，每剂中药含量为1.5 g/mL，取汁81.33 mL，4 ℃保存。

1.3 实验仪器

NanoDrop ND-1000(上海康成生物有限公司)；Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)(上海康成生物有限公司)。

1.4 模型制备

参考文献[7-8]方法，配制4 %戊巴比妥钠，根据体重以0.22 mL/100 g进行腹腔注射麻醉，腹部开口，切除大鼠双侧卵巢，造模后连续3 d使用青霉素预防感染。假手术组同法但是不切除卵巢。

1.5 分组与给药

随机将15只大鼠分为假手术组、模型组和续苓健骨方组，每组5只。造模后1周后开始灌胃给药，给药周期为连续13周，根据体重调整给予药物量，续苓健骨方组灌胃1 mL/100 g，每日1次；假手术组和模型组按1 mL/100 g灌胃生理盐水，每日1次。

1.6 样本制备

13周后，所有大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉后，取双侧股骨，生理盐水浸湿纱布并包裹左侧股骨保存于-20 ℃，实验前取出，低温下研磨加入TRIZOL于液氮速冻后放-80 ℃保存，备用。

1.7 RNA提取及测序

将3组样本，共15个样本，送至上海康成生物有限公司进行RNA提取、基因表达谱芯片扫描和差异表达基因分析及功能分析。

1.8 差异表达基因分析

样品处理，利用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1) 读取芯片图获得原始数据。使用GeneSpring GX v12.1软件(Agilent Technologies)对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理。原始数据标准化后经过筛选高质量探针(某探针在15个样品中至少有5个被标记为Detected)进行进一步分析。样品间具有统计学意义的差异表达基因通过火山图筛选。设置丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05筛选组间差异表达基因。使用R脚本进行层次聚类。使用标准的富集计算方法进行GO分析和Pathway分析。

2 结果

2.1 基因表达芯片分析结果

实验共扫描15 828个表达基因，模型组(OVX组)相比假手术组(Sham)通过显著性分析获得1 336个表达差异的基因(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，其中上调623个基因，下调713个基因。实验组(XU组)相比模型组共筛选出1 673个差异表达的基因，上调1 060个基因，下调613个基因，见图1、图2。

注：红色为基因表达上调，绿色为基因表达下调；A：Sham组与OVX组差异表达热图，B：XU组与OVX组差异表达热图。

注：红色代表基因表达上调，绿色代表基因表达下调；横坐标为基因的差异倍数，纵坐标为差异表达的显著性水平。A：Sham组和OVX组对比；B：OVX组和XU组对比。

2.2 组间差异表达基因GO分析

通过将Sham组和OVX组的差异表达基因与OVX组和XU组的差异表达基因进行分析(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，筛选出10个造模后表达显著降低但是用药后显著提高的基因，218个造模后表达显著提高但是用药后表达显著降低的基因。将筛选的228个基因进行GO分析，发现差异表达基因与生物过程相关的GO条目有326条，主要集中在应激反应和细胞间通讯上，细胞组分有29条，主要集中在细胞连接和质膜转运功能上，分子功能有66条，主要集中在跨膜活性上。表达基因结果显示生物过程(表1)、细胞组分(表2)、分子功能(表3)取前10的富集项，如图3。

表1 GO分析生物过程富集结果前十Table 1 top ten biological process enrichment results of GO analysis

表2 GO分析细胞组分富集结果前十Table 2 top ten cell component enrichment results of GO analysis

表3 GO分析分子功能富集结果前十Table 3 top ten molecular functional enrichment results of GO analysis

注：横坐标为GO富集项，纵坐标为富集显著性。

2.4 差异表达基因的KEGG富集分析

对228个差异基因进行KEGG富集分析，差异表达基因富集到36条通路，主要参与癌症通路、PI3K-Akt信号通路、长效抑制过程、轴突引导、生热作用等通路(见图5)。文献检索发现其中PI3K-Akt通路与骨质疏松症密切相关。

2.5 组间差异表达基因分析

将228个差异表达基因进一步进行筛选(丨log2 Fold change丨≥2，q<0.01)，共选出4个显著差异基因，4个均为造模后表达显著提高但是用药后表达显著降低的基因，见表5。

表4 与骨质疏松症密切相关的显著性富集通路Table 4 Significant enrichment pathways closely related to osteoporosis

表5 组间差异表达基因Table 5 differentially expressed genes between groups

注：横坐标为富集显著性，纵坐标为KEGG通路名称。

3 讨论

课题组利用基因表达谱芯片对骨质疏松症模型组、假手术组和使用续苓健骨方治疗的实验组股骨组织进行测序，结果分析表明，Sham组和OVX组有1 336个差异表达基因(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，其中上调623个基因，下调713个基因。OVX组和XU组有1 673个差异表达基因，其中上调基因有1 060个，下调基因有613个。将各组间芯片结果进行分析，筛选出10个造模后表达显著降低但是用药后显著提高的基因，218个造模后表达显著提高但是用药后表达显著降低的基因。将筛选的228个基因进行GO分析，发现差异表达基因在生物过程中、应激反应、细胞间通讯所占比例最多；在细胞组分中，主要与细胞连接、神经元突触功能组成相关；在分子功能中，主要参与跨膜活性功能。将KEGG富集分析到的前十通路进行分析，与骨质疏松症密切相关的显著性富集通路有PI3K-Akt通路等。其中通路主要相关基因有MAPK3、MYC、TP53等。PI3K-Akt信号通路被认为是包括软骨细胞、成骨细胞等细胞分化的关键途径。体内外研究均表明PI3K-Akt细胞信号通路在治疗骨质疏松症中的主要功能是促进成骨细胞增殖、分化和骨形成[9]。MAPK3有研究表明其参与的MAPK通路被证实参与骨代谢调节过程。MYC蛋白有延缓衰老的功能，其治疗骨质疏松症的机制主要在于同时能促进成骨分化，抑制破骨分化[10]。TP53编码的P53可以通过miRNA信号通路影响骨髓间充质干细胞的功能来影响成骨细胞，敲低P53能部分反转骨密度的降低[11]。课题组前期实验表明续苓健骨方可以上调骨形成基因的表达，促进成骨细胞MC3T3-E1的成骨能力，但作用通路不明确[5]，本芯片研究发现续苓健骨方治疗骨质疏松症的机制可能与PI3K-Akt信号通路促进成骨分化相关，因此基因表达谱芯片实验对前期实验的通路不明进行了补充，为后续进一步深入研究提供了方向。

在差异表达基因分析中，Dnajb6是热休克蛋白超家族之一，其参与线粒体凋亡途径，与肌肉营养不良[12]、食管癌细胞增殖生长[13]等能量代谢相关疾病密切相关；LOC102548682是组蛋白H4相关的编码基因，功能主要与控制细胞周期相关[14]；Rplp0参与多种生理和病理的过程，包括肿瘤的发生发展等[15]；Cnpy2可作为肝癌的治疗靶点[16]；目前以上4个基因暂时还没发现有与骨质疏松症相关的报道。但是文献挖掘发现有研究[17]表明Rplp0的缺失能导致活性氧(ROS)的积累，激活MAPK1/ERK2信号通路，有大量研究[18]表明MAPK1/ERK2的激活能促进成骨基因表达和成骨细胞的增殖，同时也有研究[19]发现Cnpy2的过表达能激活Akt/GSK3β通路，降低GSK3β的表达，有研究[20]发现抑制Akt/GSK3β通路，促进GSK3β表达能调控促进骨髓基质细胞的增殖，对成骨细胞凋亡产生抑制。因此综上所述，Rplp0和Cnpy2其有可能是OP相关靶点之一，且也可能是续苓健骨方治疗OP的关键基因。

传统中药历史悠久，越来越多的临床文献报道中药治疗骨质疏松具有疗效明显且不良反应相对较少的特点，但是中药治疗骨质疏松症的治疗机制和骨质疏松症的具体发病机制都较为复杂。随着芯片技术在基因表达水平研究上的普及，研究疾病机制和药物治疗机制有了新的手段。虽然本研究样本量较少，有一定的局限性，需要进一步进行验证，但是分析结果为今后的研究提供了新的思路。