UPLC-MS/MS对肾阳虚原发性骨质疏松临床代谢标志物筛查研究

郭胜男 戚晓楠 姚啸生 任路* 陈文娜*

1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847 2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110000

原发性骨质疏松症(primary osteoporosis，POP)是一种常见的骨科疾病，其特征表现为慢性的骨密度下降，骨微结构退化及低创伤性骨折风险增加。中医将其归属于“骨痿”、“骨枯”等范畴。利用超高效液相色谱-串联质谱 (ultra performance liquid chchromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法研究中医“证候”的代谢物差异，为建立基于证型的客观标准和物质量化指标提供了客观依据。本研究旨在通过家系队列，开展POP中肾阳虚证型的代谢组学研究，为中医藏象学说在临床辨证论治相关疾病提供依据。

1 材料和方法

1.1 一般资料

于2019年5月1日至2021年7月31日期间，在辽宁中医药大学附属医院骨伤科门诊和病房收集符合肾阳虚POP的患者，建立家系队列。要求同时满足POP且为肾阳虚的患者作为先证人，通过先证人联系其一级家属(父母、子女、同胞)，如其一级家属也同时患有POP且为肾阳虚，其所在家族可纳入家系队列。共收集到20例肾阳虚POP患者作为疾病组(DO组)；先证人配偶所在家系中排除POP或肾阳虚证的健康者12例作为对照组(CN组)，其资料情况见表1。

1.2 病例诊断标准

1.2.1西医诊断标准：满足其中任何一项均可诊断。①中轴骨或非优势侧桡骨远端1/3骨密度的T值≤-2.5；②-2.5

1.2.2中医辨证分型标准：同时符合以下3项方可确诊。①依据国家中医药管理局发布的《中医临床诊疗术语》的证候分型标准确诊为肾阳虚证；②依据中华中医药学会《中医体质分类与判定自测表——阳虚质》量表评分测定，转化分数>30分可确诊；③由3名副高级职称以上中医医师独立辨证，至少需两名医生诊断“肾阳虚证”可确诊。

1.3 纳入标准

①符合入选先证家系；②符合POP西医诊断标准者；③证候为肾阳虚证者；④临床病史及检验资料相对完整者；⑤受试者知情同意并签署知情同意书。

1.4 排除标准

①可能影响体内骨代谢的相关疾病，如恶性肿瘤、内分泌疾病等；②当前或过去存在血液、肾脏、肝脏、精神或神经系统疾病者；③长期服用影响骨代谢的药物(如糖皮质激素)者。

1.5 伦理审批

本研究经辽宁中医药大学附属医院医学伦理委员会批准同意实施[编号为2019064FS(KT)-040-02]。

1.6 UPLC-MS/MS采集条件

UPLC-MS/MS采集检验系统包括超高效液相色谱和串联质谱。T3液相使用沃特世ACQUITY UPLC®HSS T3 色谱柱(1.8 μm，1 mm×100 mm)。流动相的柱温设置为40 ℃，使用0.4 mL/min流速运行，A相为超纯水，B相为乙腈，各含0.1 %甲酸。Amide液相使用沃特世ACQUITY UPLC®BEH Amide色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。A相为含甲酸铵(20 mmol/L)和氨(0.4 %)超纯水，B相为纯乙腈，运行流速、柱温与T3液相相同。质谱采集时电喷雾离子源温度设为500 ℃，质谱电压正极为5 500 V，负级为4 500 V。离子源气体1流速设为55 Psi，气体2流速设为60 Psi，气帘气设为25 Psi，并设高参数的碰撞诱导电离。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 代谢组学的质控分析

质谱检测结果显示，质控样本总粒子流曲线相互重叠性高，见图1。结果表明各峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明在整个实验过程中仪器偏差引起的变异较小，反映本研究使用的仪器稳定性较高，实验结果的准确性和可重复性较好。

图1 质控样本质谱检测总粒子流重叠图Fig.1 Figure of quality control sample mass spectrometry detection

分组主成分分析结果显示DO组和CN组之间代谢物有分离趋势，见图2和图3。而偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)模型得分图(图4)显示，DO组和CN组发生了明显的分离。其中模型置换测试参数R2X (cum) = 0.392，R2Y (cum) = 0.989，Q2(cum) =0.711，提示该模型是有效的。

图2 分组主成分分析图Fig.2 Map of principal component analysis

图3 分组主成分分析三维图Fig.3 Three-dimensional map of principal component analysis

图4 偏最小二乘判别分析图Fig.4 Map of PLS-DA score S-plot

2.2 差异代谢物的筛选

利用PLS-DA和其正交信号的结果初步筛选出差异代谢物，VIP值≥1的代谢物以红色圆点表示，<1的代谢物以绿色圆点表示，见图5。进一步以VIP>1，P<0.05，FC≥1.2或≤0.65为条件，共筛选出157个差异性代谢物。

图5 正交偏最小二乘判别分析图Fig.5 Map of OPLS

对筛选的差异代谢物原始相对含量采用标准化处理，通过R软件绘制热图，结果见图6。肾阳虚POP患者血清γ-氨基丁酸、犬尿酸、尿黑酸、L-异亮氨酸、黄嘌呤、鸟苷、腺苷、十二烷二酸、肉碱 C18∶3等93个代谢物上调，谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、肌氨酸、苯乙酰甘氨酸、3-羟基马尿酸、苯乙酰甘氨酸等64个代谢物下调。

2.3 KEGG通路富集分析

分析发现肾阳虚POP患者血清差异代谢物主要参与色氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、磷脂酶D信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等信号通路，结果见图7。

图7 肾阳虚POP的差异代谢物KEGG富集图Fig.7 KEGG enrichment map of different metabolites in Yan deficiency syndrome of primary osteoporosis

3 讨论

本研究采用家系队列的研究方法，先建立肾阳虚家系队列，再进行病例纳入，以此造成了两组间性别和年龄的分布差异。与CN组比较，DO组中女性数量占比较多，年龄增高，该特征与临床肾阳虚POP患者以老年女性居多的流行病学调查结果相一致[1]。

肾主骨生髓，与骨骼的生长发育密切相关。研究发现，POP存在氨基酸和脂质方面的代谢变化[2-3]。Zhao等[4]发现去卵巢骨质疏松小鼠模型中氨基酸和核苷酸代谢下调，而脂质代谢上调。本研究经UPLC-MS/MS法筛选出157个血清差异代谢物，氨基酸、有机酸、甘油磷脂和核苷酸及其代谢产物是其主要差异代谢物种类。

3.1 氨基酸及其代谢产物

POP存在一定程度的氨基酸代谢紊乱。精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸均能促进胰岛素分泌，增强胰岛素样生长因子-1的作用，促进成骨细胞的增殖和分化[5-6]；脯氨酸、苯丙氨酸可抑制破骨细胞生成，减少POP中的骨吸收[7]。谷氨酸可通过与破骨细胞表达的谷氨酸受体结合促进骨吸收，谷氨酰胺升高则与低骨矿物质密度呈正相关[8-9]。尿黑酸中黑色素过量沉积可引起关节的炎症反应和退行性病变，出现广泛的椎间盘层状钙化和POP[10]。本研究发现，在DO组，谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和天冬氨酸水平降低，尿黑酸、γ-氨基丁酸增多。

缬氨酸可增强肠道对钙的吸收，提高机体血清钙水平。缬氨酸代谢紊乱在POP的发生发展中起一定作用，缬氨酸转氨酶缺陷可能为POP的潜在因素[9]。虽然亮氨酸与缬氨酸的吸收速度类似，但You等[9]认为POP患者不存在亮氨酸的异常代谢情况，这与本研究的结果不一致。

现有研究[11]认为，肾阳虚与神经-内分泌系统联系密切。肾阳虚患者常表现为四肢不温、言语无力、易疲劳、夜尿频多，性欲减退，面色发白，脉沉迟无力，这与交感神经功能不足的临床表现相似。丙氨酸还可转化生成苯乙酰甘氨酸，与肾上腺素受体结合兴奋交感神经[12]。本研究发现，DO组中苯乙酰甘氨酸水平降低，与张爱华[13]研究结果一致。以上结果显示，肾阳虚可能与苯乙酰甘氨酸下调以及肾上腺素受体结合能力降低有关，此观点有待于进一步研究证实。

肌氨酸在骨骼肌的能量代谢中发挥重要作用。犬尿喹啉酸又称犬尿酸，其在脂肪组织中具有提高机体能量利用、刺激脂肪代谢和产热的功能。在本研究中，DO组内血清肌氨酸含量减少，犬尿酸含量增多，提示肾阳虚POP患者骨骼肌供能可能相对不足，这与齐敏瑞等[14]的研究结果相一致。肌氨酸和犬尿酸还可以影响神经系统。肌氨酸紊乱与精神疾病的发生有关，而脑内犬尿酸累积会扰乱睡眠，引起意识紊乱[15-16]。同时，谷氨酸和天冬氨酸是中枢神经系统的兴奋性氨基酸，而γ-氨基丁酸是脑内主要的抑制性神经递质。在本研究中涉及能量代谢和影响神经系统的这些差异代谢物可能对解释肾阳虚的本质有一定意义。

3.2 脂质及其代谢产物

POP的发生发展与脂质代谢失调密切相关[9,17-19]。尹恒等[3]发现小鼠股骨骨质疏松的发生与脂质变化相关，表现为脂肪酰基、甘油脂、甾醇、一些甘油磷脂和神经酰胺增加，另一部分甘油磷酸胆碱和鞘脂类则呈下降趋势。脂质增加可激活核转录因子(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)，抑制成骨细胞分化[20-22]。POP小鼠血浆溶血磷脂酰胆碱和ROS显著上调，氧化应激损伤导致骨质丢失和骨脆性增强[23-24]。绝经期骨质疏松小鼠鞘磷脂明显减少，鞘糖脂和神经酰胺增加，表明鞘脂代谢失调与骨代谢异常密切相关[25]。此外，维生素D3及其产物和甾醇酯类似物增加可促进骨吸收，导致POP[26]。在本研究中，肾阳虚POP患者血清游离脂肪酸包括十二烷二酸、肉碱 C18∶3等增多，其具体机制不清。

3.3 核苷酸及其代谢产物

在核苷酸物质中，黄嘌呤和次黄嘌呤是嘌呤核苷酸的代谢过程中的中间产物，尿苷和胞苷则存在于嘧啶代谢途径中。本研究中，肾阳虚POP患者血浆黄嘌呤含量显著上升，提示组织中上游次黄嘌呤堆积，DNA合成速度缓慢。以此推测，肾阳虚患者疲劳、嗜睡与虚弱症状可能与氨基酸化合物消耗增加，核酸合成缓慢相关。

4 结语

代谢组学研究能够全面、综合、动态地检测出生物体内的代谢物质变化，这些检测特性与整体、辨证和恒动的中医基础理论具有一致性，能为中医诊疗提供启发性的思路和方法。利用代谢组学方法研究“证”引起的代谢物变化，为建立基于证型的客观标准和物质量化指标提供了客观依据。本研究筛选出的血清差异代谢标志物，有利于肾阳虚POP发病机制的进一步研究，为寻找中医肾阳虚证的生物学本质提供了理论依据。