鸡冠花黄酮对骨质疏松大鼠TMAO/NF-κB/NFATc1水平的影响

邓满香 陈鹭玲 何剑全

厦门大学附属中山医院，福建 厦门 361000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量降低，骨微结构破坏骨脆性增加的全身性疾病[1-2]。骨微结构主要受到骨代谢的影响，可参与骨重建，具有维持骨结构及功能完整性的作用[3]。OP患者存在骨微结构改变，表现为成骨细胞分化及聚集降低、骨小梁分布降低、骨脆性增加、提高骨折发生风险。骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BAP)是由成骨细胞分化而成，可增加羟磷灰石沉积，抑制骨盐形成，是反映成骨细胞活性及骨形成的敏感指标[4]。氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)是存在于血液循环中和慢性肾病及心脑血管疾病关系密切的指标。以往文献[5]证实，糖尿病肾病患者血清中TMAO表达升高并随着疾病加重而升高，但与OP疾病水平暂无研究。核因子Kappa B (nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一种具有生物调节作用的蛋白质，能够介导炎症反应、细胞生物活性及免疫应答等，在OP时表达升高可促进骨炎症反应[6]。活化T细胞核转录因子c1 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATcl)是重要转录因子，在破骨细胞中可结合上游信号通路提高破骨细胞活性及提高骨基质的降解作用[7]。

鸡冠花(Celosia cristata L)为苋科草本植物，其性温、无毒，药理作用具有收涩、止血、止带扽功效。近些年，国内外大量学者对鸡冠花的有效成分进行分析，其黄酮类活性物质更为丰富，具有抗衰老、抗肿瘤、提高免疫能力及抗骨质疏松等作用[8]。本文通过建立老年OP大鼠，观察鸡冠花黄酮提取物对骨微结构、骨特异性磷酸酶及TMAO-NF-κB/NFATc1水平的影响，为OP临床用药提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验大鼠

50只SPF级SD雄性大鼠，16周龄，购自广东省医学实验动物中心，平均体重300～350 g，许可证号：SCXK(粤)2020—0028，在常温下湿度为55%下分笼喂养，5只1笼。所有涉及动物的操作严格遵循实验动物伦理要求。模拟黑白交替无菌饮食2周及按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2 主要材料与方法

4 %多聚甲醛(Sigma-Aldrich Inc，USA)；0.9 %生理盐水(中国大冢制药有限公司)；兔抗TMAO；NF-κB, NFATc 1抗体(Cell Singal Technology，美国)；GAPDH抗体(Proteintech，美国)；伊红-苏木精染色液(杭州华东医药有限公司)；自动生化分析仪(Au5400 Beckman Coulter Inc., Massachusetts CA, USA)；普通显微镜(Olympus, Japan)；蛋白电泳仪(北京六一仪器)。

1.3 鸡冠花黄酮提取物制备

我院微生物与免疫学教研室于2020年10月中下旬采收普通鸡冠花的花序；除去种子和茎梗，烘干后粉碎备用。乙醚回流抽提7 h，脱脂后的样品再用95 %乙醇于65 ℃水浴上提取6 h，蒸发干燥得粉剂，溶解后再过滤除菌。

1.4 分组、OP模型制备及干预方法

将大鼠随机分为Sham组、模型组、干预组及药物对照组，术前禁食12 h、禁水6 h，1 %戊巴比妥钠麻醉，用量4 mg/kg，四肢刺激无反应，麻醉成功。于两侧肋下剃毛，消毒后，在肋下2 cm脊柱旁1.5 cm作纵向开口，腹腔内找到菜花样卵巢组织结扎并切除，无活动出血后将周围组织塞入腹腔并缝合皮肤，Sham组保留卵巢切除周围脂肪组织，依次缝合切口，加压包扎，术后常规皮下注射青霉素1万U/d，连用3 d，预防感染。采集阴道分泌物进行涂片检查，镜检脱落细胞密集者为去势成功。去势成功且血钙和双侧胫骨骨密度明显低于Sham组，为老年骨质疏松模型制备成功。剔除死亡大鼠6只。Sham组、模型组、干预组及药物对照组分别为13只、模型组9只、干预组11只、药物对照组11只。干预组采用鸡冠花黄酮提取物100 mg/(kg.d)灌胃，药物对照组采用0.3 g/kg的钙尔奇碳酸钙D3片，其余大鼠均灌胃等体积0.9 %的生理盐水，每日灌胃1次，连续干预16周。

1.5 血清Ca、P、ALP及BAP水平

收集大鼠尾部静脉血2 mL，加入无抗凝剂的试管中，离心分离沉淀的血清以4 000 r/min 10 min，检测上清液中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)及骨特异性碱性磷酸酶(BAP)水平。

1.6 micro CT测量股骨骨微结构及骨密度

干预后，麻醉处死大鼠，分离双侧股骨组织，采用手术刀剃净股骨大分布组织，将左侧股骨放入浸泡于10 %福尔马林固定，用于骨微结构micro CT分析，分组股骨组织骨密度(BMD)利用该系统软件进行分析并经自动统计给出结果。

1.7 HE染色检测组织病理形态

组织浸入10 %的甲醛溶液，固定过夜，自来水冲洗，浸泡于14 %的EDTA溶液中脱钙，逐级脱水经石蜡包埋后4 μm切片后备用。各组股骨组织切片放入37 ℃复温15 min，二甲苯脱蜡后按照100 %-95 %-85 %及75 %乙醇-100 %蒸馏水进行逐级水化，苏木精染色10 min，盐酸(1%)处理，伊红复染，梯度乙醇脱水，封片后观察组织形态。

1.8 免疫组化检测TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达

股骨组织剪切成小块，脱水、包埋后，采用甲醛固定，水化后，37.5 ℃静置后0.5 h后，加入1 % 的EDTA液，山羊血清封闭。加入TMAO抗体(1∶500)、NF-κB(1∶700)及NFATc1(1∶1000)抗体，加入二抗0.5 h后，复染，封片。以淡黄色至棕褐色，为阳性，随机选取每一张免疫组化切片的5个视野，并用MIAS医学图像分析系统进行分析。

1.9 免疫印迹检测TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白表达

股骨组织加入胰蛋白裂解液，离心后采取上清液加入样孔。进行电泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反复PBS冲洗，5 min/次，分别加入TMAO抗体(1∶1 000)、NF-κB(1∶800)及NFATc1(1∶1 500)抗体、过加入抗兔IgG二抗(1∶2 000)，杂交5 min采用PBS冲洗3次，后放入ECL工作液中，随后进行检测，获取图象。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平比较

与Sham组相比，模型组大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平均降低(P<0.05)，与模型组相比，干预组大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平升高(P<0.05)；干预组与药物对照组上述指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平比较Table 1 Comparison of serum Ca, P, ALP and BAP levels in each

2.2 各组大鼠骨微结构及骨密度比较

Sham组股骨组织中骨小梁多呈现板状，致密均匀。模型组大鼠股骨组织骨小梁稀疏，与模型组大鼠股骨组织相比，干预组及药物对照组大鼠股骨组织骨小梁数量、骨小梁连接密度均提高，见图1。Sham组、模型组、干预组及药物对照组的骨密度BMD分为(58.05±6.11)mg/cm3、(47.50±4.53)mg/cm3、(55.17±5.14)mg/cm3及(54.96±5.40)mg/cm3，组间比较差异具有统计学意义(F=6.983，P<0.001)，与Sham组比较，模型组BMD降低(P<0.05)，与模型组相比，干预组BMD升高(P<0.05)，干预组和药物对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图1 各组大鼠骨微结构比较Fig.1 Comparison of bone microstructure in each group

注：与Sham组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.3 HE染色观察各组大鼠股骨组织病理形态

Sham组大鼠股骨形态饱满，排列整齐无断层，骨小梁形态连续，未见空洞。模型组骨小梁组织变细，骨小梁出现断裂及不连续，骨基质紊乱分布，骨密质间断裂及较多空洞形成。干预组及药物对照组骨小梁组织逐渐改变，排列紧致，骨基质紊乱改善空洞减少。见图3。

图3 各组大鼠股骨组织形态比较(50×)Fig.3 Comparison of the morphology of femur in each group (50×)

2.4 免疫组化检测各组大鼠组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达

与Sham组相比，模型组大鼠股骨组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达较高(P<0.05)，与模型组相比，干预组大鼠组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，干预组和药物对照组上述指标之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图4。

图4 各组大鼠组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达Fig.4 Positive expression of TMAO, NF-κB and NFATc1 in each group

表2 各组大鼠组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达

2.5 免疫印迹检测各组大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平

与Sham组相比，模型组大鼠股骨组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达较高(P<0.05)，与模型组相比，干预组大鼠组织中TMAO、NF-κB、NFATc1阳性表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，干预组和药物对照组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平

3 讨论

钙和磷都是人体必需元素，99 %的钙均是以羟基磷灰石结晶形式储存在骨组织中，1 %的钙主要分布在体液及软组织中，可参与凝血及肌肉收缩等作用。80 %磷以磷酸钙的形式储存在骨组织中，磷可辅助钙共同调控机体生理功能[9-10]。ALP主要表达在骨钙化区域，联合水解酶作用磷酸酯释放钙以沉淀方式附着于胶原骨架上，有利于成骨。BAP是由肝脏及成骨细胞合成，在成骨过程中可水解成磷酸脂，其表达升高有利于骨形成[11]。本文研究表示，干预组大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平均高于模型组，说明鸡冠花黄酮提取物可通过增加OP骨代谢指标而改善骨质疏松。相关研究[12]证实，植物雌激素可有效抑制绝经后骨量丢失，黄酮类物质已经被证实增加骨质量而增加骨形成。鸡冠花黄酮是从鸡冠花中提取的有效活性成分，对OP中血钙及血麟具有调节作用，可通过减少骨钙修饰而改善OP。Cho等[13]研究表示，鸡冠花生物学功能广泛，可增加骨密度而减少钙流失的同时，通过体外成骨细胞实验，发现鸡冠花黄酮提取物可通过增加成骨细胞活性而增加矿化能力。因此本文推测鸡冠花黄酮提取物可能是通过增加成骨细胞活性，提高骨质量而增加BAP表达。

图5 各组大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平Fig.5 Protein levels of TMAO, NF-κB and NFATc1 in each group

本文采用Micro CT对各组大鼠股骨组织骨小梁进行三维结构重建，可对骨小梁厚度、间距及体积进行分析，可通过获得骨参数可预测骨强度。BMD表示骨密度，是骨骼强度的重要指标。谢菲尔德大学学生健康中心认为BMD水平降低是导致OP疾病发生的主要原因，也是合并骨折发生的危险因素[14]。国际学者研究表明，在OP大鼠中采用双能X线骨密度检测仪器能够通过评估BMD含量而反映OP改善程度[15]。黄酮类化合物及衍生物对可被用来抗骨质疏松，鸡冠花黄酮提取物抗OP主要机制在于可增加成骨细胞活性，提高骨密度增加骨形成量，还可通过减少破骨细胞募集而改善骨吸收，还可通过加快骨胶原合成及基质矿化而发挥抗OP作用。李万里等[16]研究表示，在成骨细胞体外实验中采用鸡冠花黄酮提取物培养后，IGF-1表达升高说明鸡冠花黄酮提取物可增加成骨细胞活性而增加骨小梁厚度发挥预防OP的作用。

本文研究表示，干预组大鼠股骨组织中TMAO、NF-κB、NFATc1表达均低于模型组，说明鸡冠花黄酮提取物可抑制TMAO、NF-κB、NFATc1水平抑制老年OP。TMAO属于一类促炎性反应因子，在糖尿病及肾脏疾病中TMAO升高可增加氧化应激反应[17]。慢性肾脏疾病可导致人体矿物质及骨状态发展改变，可增加患者OP发生及骨折发生风险，TMAO升高可加重糖尿病肾病发生发展而加快OP形成，因此抑制其表达可一定程度上发挥骨保护作用。OP发生时氧化应激持续激活可增加NF-κB表达，可与 TNF-α 受体(TNFR) 结合后增加骨基质细胞分泌因子κB 受体活化因子受体配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL) 及巨噬细胞集落刺激因子等，促进破骨细胞的增殖、分化，抑制其凋亡，增强其骨吸收能力[18]。NFATcl是破骨细胞形成及分化过程中必不可少的调节因子，当其被敲除后采用RANKL刺激后破骨细胞无法分化，说明NFATcl对于破骨细胞形成及功能发挥中具有重要作用[19]。黄酮类提取物可对NF-κB及其受体RANKL发挥抑制作用，例如补骨脂异黄酮可通过抑制NF-κB激活而减少破骨细胞分化而增加成骨细胞活性而减少骨量丢失，对OP发挥改善作用。鸡冠花还有丰富的黄酮类化合物，可发挥抗炎症、抗氧化应激及抗OP作用。李万里等[20]研究表示，鸡冠花黄酮提取物对氟中毒骨代谢异常大鼠可通过改善骨代谢紊乱，降低炎症反应而提高骨密度，促进骨形成。本文推测鸡冠花黄酮提取物可通过发挥强大抗炎症作用而抑制NF-κB及其受体RANKL表达，降低破骨细胞活性而预防OP发生发展。

本文研究存在一定不足，未建立不同浓度的鸡冠花黄酮提取物组别，时间及经费受限，可能影响实验结果。今后加强与其他单位联合增加实验方法和实验结果，为老年OP治疗提供实验依据。综上所述，老年骨质疏松大鼠采用鸡冠花黄酮提取物干预后可显著改善骨微结构，提高骨特异性磷酸酶活性增加骨密度，机制可能与抑制TMAO、NF-κB、NFATc1表达相关。