α-KGDHC酶活性及琥珀酰化修饰对缺血性脑卒中的适应性再灌注大鼠脑保护的机制研究*

陈旭 龚绍慧 余斌 詹剑

缺血性脑卒中是由于脑部血管阻塞引起脑组织缺血、缺氧，造成脑组织损伤，严重者对患者脑部神经功能造成严重的影响，主要表现为偏瘫、语言、感觉等障碍[1-2]。降低因缺血缺氧导致的神经损伤是脑神经领域研究的热点，目前认为线粒体在缺血性脑卒中的神经细胞恢复方面发挥重要作用，但其作用机制复杂，尚无确切定论[3]。线粒体是生物氧化及能量转换的重要场所，其中线粒体酶系在线粒体功能的发挥中至关重要，α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-KGDHC）是其中重要的一员，是调节有氧代谢中的速度酶[4-5]。相关研究认为，α-KGDHC活性能够影响脑组织的能量代谢，当其活性较低时，会造成脑组织损伤，影响脑的正常功能[6]。同样有研究证实，α-KGDHC 对于脑组织中活性氧的浓度具有一定的调节作用[7]。α-KGDHC 能够作为转琥珀酰酶，发挥调节琥珀酰化修饰的作用，有研究表明，抑制α-KGDHC 活性能够降低线粒体蛋白质的琥珀酰化，从而减轻缺血再灌注的组织损伤[8]。因此推测α-KGDHC 与缺血性脑卒中具有一定的联系。目前关于α-KGDHC 酶活性及琥珀酰化修饰对缺血性脑卒中的研究较少，本研究对其影响及作用机制进行探究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠，级别：清洁级，数量：50 只，周龄：8 周龄，体重：187～223 g，平均（203±15）g，由山西省医科大学提供，许可证为[生产许可SCXK（晋）2019-0004]，经动物伦理委员会批准。

1.2 主要材料与仪器 3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）（CAS：1460-34-0，生产厂家：上海源叶生物科技有限公司，规格：5 g）；戊巴比妥钠（CAS：57-33-0，生产厂家：上海易汇生物科技有限公司，规格：5 g）；红四氮唑（CAS：298-96-4，生产厂家：北京凯诗源生物科技有限公司，规格：500 g）；α-KGDHC酶联免疫试剂盒（上海一基实业有限公司，货号：YJ000643）；小动物动脉夹（上海玉研科学仪器有限公司，型号：Y501-08 型），小动物脑血流仪（上海玉研科学仪器有限公司，型号：LAB）；酶标仪（奥地利Infinite 公司，型号：200 Pro）；蛋白质质谱分析仪（北京百泰派克生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分组 从50 只雄性清洁级大鼠中随机选取10 只作为Sham 组（仅分离颈动脉，不结扎），其余大鼠通过结扎颈动脉建立脑缺血模型。所有大鼠均进行麻醉处理（2%戊巴比妥钠，30 mg/kg），将大鼠固定后对颈部进行消毒，沿颈部中线做一切口，分离肌肉组织后剥离出颈内、外动脉及颈总动脉，采用动脉夹将颈总动脉夹闭，并结扎颈外动脉，将尼龙线栓插入颈内动脉，当继续插入感受到阻力时停止并固定，取下动脉夹，阻塞脑中动脉建立脑缺血模型。整个操作过程进行大鼠脑部血流量监测，脑缺血建模成功标注：线栓插入完全后，血流量下降超过20%。

35 只大鼠脑缺血模型建立成功，并随机分为NR 组、AR 组、NR+3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）组各9 只，AR+KMV 组8 只，各组再进行再灌注处理。

再灌注：所有大鼠缺血0.5 h 后抽出线栓，NR操作为：直接取出线栓后缝合，完全开放脑血流量，15 min 后处死，AR 操作为采用动脉夹，控制为开放1/2 脑血流量退出线栓并缝合，0.5 h 后处死。脑缺血再灌注建模成功标准：线栓取出后，脑血流量上升至基线的70%（10 min 内）。35 只大鼠均成功建立再灌注模型（术中应维持大鼠核心体温）。

1.3.2 药物处理 根据人与实验动物药物剂量换算公式[9]，NR+KMV 组、AR+KMV 组均于缺血后腹腔注射给予10 μL 的KMV（0.2 mol/L），其余组给予等量的生理盐水。

1.3.3 大鼠脑组织α-KGDHC 活性检测 所有大鼠麻醉处理后迅速处死，取损伤脑组织，置于液氮中冷冻保存，加入适量缓冲液，研磨成匀浆，低温离心（5 000 r/min，15 min）收集上清液，采用α-KGDHC 酶联免疫试剂盒进行检测，加入反应混合液反应5 min，记录340 nm 波长激发后，460 nm发射荧光的光密度值，计算α-KGDHC 活性。

1.3.4 大鼠脑梗区域占比情况 取各组冻存的脑组织，于切片模具中制作脑组织切片（2 mm），将切片置于2% 红四氮唑溶液中染色0.5 h，染色完成后与黑色背景下拍照并观察，采用scionimage 软件分析计算梗死面积，白色区域为梗死面积，紫红色为非梗死区域。脑梗区域占比=梗死体积/总体积×100%。

1.3.5 蛋白质琥珀酰化变化情况 采用免疫沉淀-质谱分析线粒体检测蛋白质琥珀酰基表达量，各组取部分冻存脑部位，研磨成匀浆后加入裂解液，裂解脑组织、细胞，低温下使用超声探针进行冲击（冲击3 次，每次间隔15 s），离心后取上清液，置于EP 管中，加入蛋白酶抑制剂，冰上反应5 min，将蛋白质稀释至200 μg/mL，加入稀释好的赖氨酸琥珀酰化抗体（稀释比1∶200），再加入20 μL/mL的蛋白A 琼脂糖磁珠，低温孵育过夜，洗涤后进行洗脱，并对所得肽段进行LC/MS/MS 分析。

1.4 统计学处理 利用SPSS 19.0 软件处理数据。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

各组α-KGDHC 活性经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham 组比较，NR 组α-KGDHC 活性低（P＜0.05）；与NR 组比较，AR组α-KGDHC 活性高，NR+KMV 组α-KGDHC活性低（P＜0.05）；与AR 组比较，AR+KMV 组α-KGDHC 活性低（P＜0.05）；各组脑梗区域占比经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham 组比较，NR 组脑梗区域占比高（P＜0.05）；与NR 组比较，AR 组脑梗区域占比低，NR+KMV组脑梗区域占比高（P＜0.05）；与AR 组比较，AR+KMV 组脑梗区域占比高（P＜0.05）；各组赖氨酸琥珀酰基表达量经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham 组比较，NR 组赖氨酸琥珀酰基表达量低（P＜0.05）；与NR 组比较，AR 组赖氨酸琥珀酰基高，NR+KMV 组赖氨酸琥珀酰基表达量低（P＜0.05）；与AR 组比较，AR+KMV 组赖氨酸琥珀酰基表达量低（P＜0.05）。见表1。

表1 大鼠脑组织α-KGDHC活性水平、脑梗区域占比及赖氨酸琥珀酰基表达量比较（）

表1 大鼠脑组织α-KGDHC活性水平、脑梗区域占比及赖氨酸琥珀酰基表达量比较（）

*与Sham 组比较，P＜0.05；#与NR 组比较，P＜0.05；△与AR 组比较，P＜0.05。

3 讨论

缺血性脑卒中由于脑部血管堵塞导致脑组织缺氧缺血，即使在及时的治疗下恢复血液流通，依旧会对脑组织造成一定的损伤，因此近年来学者致力于降低缺血再灌注对于脑组织的损伤[10-11]。目前认为缺血再灌注损伤是由于缺血、缺氧导致线粒体功能受损，并产生大量的氧自由基，当其浓度过高时会诱导细胞凋亡或坏死，从而导致脑组织损伤[12-13]。因此，保护线粒体功能是改善缺血再灌注的重点。α-KGDHC 是三羧酸循环中的关键酶，而三羧酸循环是线粒体功能的重要部分，是氧自由基的生成的重要途径[14-15]。因此α-KGDHC 活性对于改善缺血性脑卒中的适应性再灌注具有研究意义。

本研究显示，与Sham 组比较，NR 组α-KGDHC活性及赖氨酸琥珀酰基表达量低，脑梗区域占比高，表明缺血后再灌注会降低α-KGDHC，减少琥珀酰化，脑损伤面积增加。原因为脑缺血缺氧后有氧代谢受阻，氧化磷酸化过程无法正常进行，但三羧酸循环依旧能进行，产生大量还原型辅酶，在α-KGDHC 的作用下生成H2O2，而H2O2则会反向抑制α-KGDHC 活性，导致α-KGDHC 降低[16-17]。当再灌注后，虽恢复氧供给，但三羧酸循环受损，恢复较慢，另外缺血时还会产生大量的次黄嘌呤，再灌注时，在氧的作用下生成黄嘌呤并释放氧自由基，进一步抑制α-KGDHC 活性[18-19]。AR 则会减轻部分脑损伤，增加α-KGDHC 活性及赖氨酸琥珀酰化修饰，表明相较于NR，AR 对于脑组织具有一定的保护作用，其作用机制可能与α-KGDHC 活性的增加有关。能够逐步增加氧供给，使三羧酸循环逐步恢复，减少还原型辅酶的堆积，同时减少氧自由基的产生，降低对α-KGDHC 活性的抑制作用[20]。为证实AR 通过α-KGDHC 活性对脑组织的保护作用，本研究通过加入α-KGDHC 活性抑制剂KMV，结果显示，在NR 的基础上给予KMV 则会抑制α-KGDHC 活性及赖氨酸琥珀酰化修饰，增加脑梗面积，在AR 的基础上给予KMV 同样会抑制α-KGDHC 活性及赖氨酸琥珀酰化修饰，增加脑损伤，该结论进一步证实AR 对于脑组织的保护作用与α-KGDHC 活性有关。而α-KGDHC 能够作为转琥珀酰酶发挥作用，当α-KGDHC 活性较高的情况下能够促进赖氨酸琥珀酰化修饰。

综上所述，α-KGDHC 酶活性及琥珀酰化修饰能够改善缺血性脑卒中的AR 的损伤，对大鼠脑组织具有保护作用。